论文部分内容阅读
研究背景及意义:结直肠癌(colorectal cancer)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020全球最新癌症负担数据表明2020年结肠癌新发病例数在所有癌症中在世界排第三，中国排第二。临床数据表明近20年来结肠癌患者人数显著上升，因此对结肠癌的早期筛查和如何抑制病情的恶化成为当今医学迫在眉睫需要攻克的难关。所以如何对结肠癌进行早期筛查和控制的研究具有十分重要的临床意义。
外泌体(exosome)是一种由细胞产生的直径在30-150nm的胞外囊泡，天然存在包括腹水、淋巴液、乳汁、唾液、羊水等的体液当中。外泌体携带着原细胞中多种蛋白质、核酸和脂质等重要物质，在细胞的信息与物质传递当中起着重要的作用。在生理和病理上外泌体也同样发挥着重要的功能，比如肿瘤的增殖和迁移，心血管疾病等。那么血浆外泌体是否在结肠癌患者的早期筛查和治疗发挥作用呢，目前我们还不清楚。
本课题我们主要将正常人、原位结肠癌(Ⅱ期)患者和结肠癌肝转移(Ⅳ期)患者的血浆外泌体进行单外泌体分群。单外泌体分群是根据外泌体膜上的一些蛋白分子标记物，通过机器学习将不同标记的血浆外泌体分群，来溯源结肠癌患者相对于正常人中哪些外泌体亚群发生了变化。我们发现癌细胞来源的ITGB3阳性外泌体在转移性结肠癌患者血浆中的比例显著上升，而单核/巨噬细胞来源的ITGAM阳性外泌体则在结肠癌患者血浆中基本消失。之后我们验证这两种来源的外泌体的功能，发现ITGAM阳性外泌体抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭而ITGB3阳性外泌体会促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。进一步研究发现健康人、腺瘤患者和原位结肠癌患者血浆外泌体中ITGAM的表达依次减少，这为结肠癌的早期筛查提供了一个新思路，肝转移患者血浆外泌体中ITGB3的表达显著升高，提示ITGB3的表达高低为结肠癌的转移及治疗找到了新的标记物及治疗措施。
研究方法:利用单外泌体分群技术，将人体血浆中不同来源的外泌体进行分群，找出正常人和结肠癌患者血浆中发生变化的外泌体亚群。然后用westernblot来验证结果。PKH26染外泌体，DAPI染核，验证外泌体的摄取。分别提取正常人的血浆外泌体、结肠癌肝转移病人的血浆外泌体、THP-1及单核巨噬细胞来源的外泌体及慢病毒转染的ITGB3过表达的外泌体然后孵育HCT116和SW480人结肠癌细胞系，来观察癌细胞的增殖、迁移和侵袭变化。
研究结果:ITGAM外泌体亚群在正常人血浆中比例为22.79％，但是在原位和结肠癌肝转移病人的血浆中分别为0.79％和1.28％，占比明显下降。而ITGB3阳性外泌体亚群在结肠癌肝转移病人血浆中的比例为76.34％，远高于正常人和原位结肠癌病人，分别为27.71％和32.76％。westernblot结果也证实了正常人血浆外泌体中的ITGAM的表达确实高于结肠癌患者，在结肠癌肝转移病人血浆外泌体中ITGB3的表达高于正常人及原位结肠癌患者。细胞功能实验包括集落形成实验和细胞的迁移和侵袭实验显示正常人血浆外泌体及THP-1巨噬细胞及单核巨噬细胞来源的外泌体抑制结肠癌的增殖、迁移和侵袭而过表达ITGB3的癌细胞来源外泌体，明显促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
结论:
1.ITGAM和ITGB3阳性外泌体在正常人和原位结肠癌患者、结肠癌肝转移患者的血浆外泌体中的表达有很大差异。正常人血浆外泌体ITGAM阳性外泌体亚群占比明显高于结肠癌患者，而ITGB3阳性外泌体亚群占比在结肠癌肝转移患者血浆中明显增加。
2.单核巨噬细胞来源的ITGAM阳性外泌体亚群明显抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而癌细胞来源的ITGB3阳性外泌体亚群则促进结肠癌细胞的增殖迁移和侵袭。
3.ITGAM在血浆外泌体的表达水平在正常人、癌前病变(腺瘤患者)和原位结肠癌患者中逐渐下降，提示可能作为结肠癌的早癌标记物用于临床初筛。
外泌体(exosome)是一种由细胞产生的直径在30-150nm的胞外囊泡，天然存在包括腹水、淋巴液、乳汁、唾液、羊水等的体液当中。外泌体携带着原细胞中多种蛋白质、核酸和脂质等重要物质，在细胞的信息与物质传递当中起着重要的作用。在生理和病理上外泌体也同样发挥着重要的功能，比如肿瘤的增殖和迁移，心血管疾病等。那么血浆外泌体是否在结肠癌患者的早期筛查和治疗发挥作用呢，目前我们还不清楚。
本课题我们主要将正常人、原位结肠癌(Ⅱ期)患者和结肠癌肝转移(Ⅳ期)患者的血浆外泌体进行单外泌体分群。单外泌体分群是根据外泌体膜上的一些蛋白分子标记物，通过机器学习将不同标记的血浆外泌体分群，来溯源结肠癌患者相对于正常人中哪些外泌体亚群发生了变化。我们发现癌细胞来源的ITGB3阳性外泌体在转移性结肠癌患者血浆中的比例显著上升，而单核/巨噬细胞来源的ITGAM阳性外泌体则在结肠癌患者血浆中基本消失。之后我们验证这两种来源的外泌体的功能，发现ITGAM阳性外泌体抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭而ITGB3阳性外泌体会促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。进一步研究发现健康人、腺瘤患者和原位结肠癌患者血浆外泌体中ITGAM的表达依次减少，这为结肠癌的早期筛查提供了一个新思路，肝转移患者血浆外泌体中ITGB3的表达显著升高，提示ITGB3的表达高低为结肠癌的转移及治疗找到了新的标记物及治疗措施。
研究方法:利用单外泌体分群技术，将人体血浆中不同来源的外泌体进行分群，找出正常人和结肠癌患者血浆中发生变化的外泌体亚群。然后用westernblot来验证结果。PKH26染外泌体，DAPI染核，验证外泌体的摄取。分别提取正常人的血浆外泌体、结肠癌肝转移病人的血浆外泌体、THP-1及单核巨噬细胞来源的外泌体及慢病毒转染的ITGB3过表达的外泌体然后孵育HCT116和SW480人结肠癌细胞系，来观察癌细胞的增殖、迁移和侵袭变化。
研究结果:ITGAM外泌体亚群在正常人血浆中比例为22.79％，但是在原位和结肠癌肝转移病人的血浆中分别为0.79％和1.28％，占比明显下降。而ITGB3阳性外泌体亚群在结肠癌肝转移病人血浆中的比例为76.34％，远高于正常人和原位结肠癌病人，分别为27.71％和32.76％。westernblot结果也证实了正常人血浆外泌体中的ITGAM的表达确实高于结肠癌患者，在结肠癌肝转移病人血浆外泌体中ITGB3的表达高于正常人及原位结肠癌患者。细胞功能实验包括集落形成实验和细胞的迁移和侵袭实验显示正常人血浆外泌体及THP-1巨噬细胞及单核巨噬细胞来源的外泌体抑制结肠癌的增殖、迁移和侵袭而过表达ITGB3的癌细胞来源外泌体，明显促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
结论:
1.ITGAM和ITGB3阳性外泌体在正常人和原位结肠癌患者、结肠癌肝转移患者的血浆外泌体中的表达有很大差异。正常人血浆外泌体ITGAM阳性外泌体亚群占比明显高于结肠癌患者，而ITGB3阳性外泌体亚群占比在结肠癌肝转移患者血浆中明显增加。
2.单核巨噬细胞来源的ITGAM阳性外泌体亚群明显抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而癌细胞来源的ITGB3阳性外泌体亚群则促进结肠癌细胞的增殖迁移和侵袭。
3.ITGAM在血浆外泌体的表达水平在正常人、癌前病变(腺瘤患者)和原位结肠癌患者中逐渐下降，提示可能作为结肠癌的早癌标记物用于临床初筛。