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随着代谢工程和合成生物学的发展，芳香族化合物的生物合成备受关注。肉桂胺是由L-苯丙氨酸衍生而来的一种芳香族化合物，主要应用在生物活性分子、活性药物、含能材料的合成等方面，具有较大的研究价值。肉桂胺主要通过化学法合成，但是该方法具有污染大、成本高的弊端。目前，以肉桂胺生产为目标的生物合成法还未报道，迫切需要我们建立一种高效的肉桂胺生物合成方法。本文致力于大肠杆菌中从肉桂酸到肉桂胺的生物合成途径的构建，以肉桂醛的生物合成为基础，参考其他胺类化合物体外酶法合成的相关研究，利用ω-转氨酶催化转氨反应从而使肉桂醛转化为肉桂胺，首次打通了大肠杆菌中从肉桂酸到肉桂胺的生物合成途径，并依托一系列的代谢工程策略不断提升肉桂胺产量。
肉桂胺生物合成中最重要的一步是寻找高效的转氨酶。因此，我们首先筛选了不同来源的转氨酶，验证了来源于Chromobacteriumviolaceum的转氨酶(Cv-ωTA)和来源于Halomonaselongata的转氨酶(He-ωTA)的对肉桂醛的催化活性，选择Cv-ωTTA催化从肉桂醛至肉桂胺的氨基转移反应。基于大肠杆菌中肉桂醛合成所需要的酶，我们选择了来源于Streptomycescoelicolor的4-香豆酸:CoA连接酶(Sc4CL)以及来源Arabidopsisthaliana的肉桂酰-CoA还原酶(AtCCR)催化肉桂酸还原为肉桂醛，并将Sc4CL、AtCCR以及Cv-ωTA的编码基因插入pColA-Duet-1质粒上构建了生产质粒pocE，验证肉桂酸至肉桂胺的合成路线是否可行。但是我们发现实际发酵过程中肉桂醛极易被大肠杆菌内源性的醛酮还原酶和醇脱氢酶催化而转化为肉桂醇，这种副产物的形成严重阻碍了肉桂胺的生产。为了解决这一问题，我们利用靶向敲除了若干个醛酮还原酶基因和醇脱氢酶基因的MG1655(RARE)菌株并更换碳源降低了菌株发酵过程中产生的还原力，发现利用LB培养基发酵的条件下产生的肉桂醇最少，有利于肉桂胺的合成。同时，通过更换不同拷贝数的载体，利用拷贝数相对较高的pET-Duet-1载体成功实现了肉桂酸到肉桂胺的合成，肉桂胺产量为8.63mg/L。
肉桂胺的产量还有较大的提升空间，为了进一步优化肉桂胺产量，我们筛选了不同来源的羧酸还原酶，利用来源于克氏菌的羧酸还原酶(NcCAR)和来源于大肠杆菌的磷酸泛肽基转移酶(PPTase)与Cv-ωTA共同表达时产生的肉桂胺最多，在添加100mg/L的肉桂酸时合成了42.60mg/L的肉桂胺。为了提升转氨酶的催化性能，我们依托肉桂醛和CV-ωTA分子对接的结果，对转氨酶的Phe22、Tyr168以及Ala231位点进行了饱和突变，构建了含有57个突变体的库，并通过组合突变的方法寻找最佳的转氨酶突变体。通过比较产量和转化率，选择了Y168G突变体合成肉桂胺。最后，我们通过过表达zwf基因，为肉桂酸到肉桂醛合成提供所需要的辅因子NADPH，并通过优化辅因子PLP的浓度和氨基供体丙氨酸的浓度，在以肉桂酸钠为前体的条件下将肉桂胺的产量提升到523.15mg/L的水平。
肉桂胺生物合成中最重要的一步是寻找高效的转氨酶。因此，我们首先筛选了不同来源的转氨酶，验证了来源于Chromobacteriumviolaceum的转氨酶(Cv-ωTA)和来源于Halomonaselongata的转氨酶(He-ωTA)的对肉桂醛的催化活性，选择Cv-ωTTA催化从肉桂醛至肉桂胺的氨基转移反应。基于大肠杆菌中肉桂醛合成所需要的酶，我们选择了来源于Streptomycescoelicolor的4-香豆酸:CoA连接酶(Sc4CL)以及来源Arabidopsisthaliana的肉桂酰-CoA还原酶(AtCCR)催化肉桂酸还原为肉桂醛，并将Sc4CL、AtCCR以及Cv-ωTA的编码基因插入pColA-Duet-1质粒上构建了生产质粒pocE，验证肉桂酸至肉桂胺的合成路线是否可行。但是我们发现实际发酵过程中肉桂醛极易被大肠杆菌内源性的醛酮还原酶和醇脱氢酶催化而转化为肉桂醇，这种副产物的形成严重阻碍了肉桂胺的生产。为了解决这一问题，我们利用靶向敲除了若干个醛酮还原酶基因和醇脱氢酶基因的MG1655(RARE)菌株并更换碳源降低了菌株发酵过程中产生的还原力，发现利用LB培养基发酵的条件下产生的肉桂醇最少，有利于肉桂胺的合成。同时，通过更换不同拷贝数的载体，利用拷贝数相对较高的pET-Duet-1载体成功实现了肉桂酸到肉桂胺的合成，肉桂胺产量为8.63mg/L。
肉桂胺的产量还有较大的提升空间，为了进一步优化肉桂胺产量，我们筛选了不同来源的羧酸还原酶，利用来源于克氏菌的羧酸还原酶(NcCAR)和来源于大肠杆菌的磷酸泛肽基转移酶(PPTase)与Cv-ωTA共同表达时产生的肉桂胺最多，在添加100mg/L的肉桂酸时合成了42.60mg/L的肉桂胺。为了提升转氨酶的催化性能，我们依托肉桂醛和CV-ωTA分子对接的结果，对转氨酶的Phe22、Tyr168以及Ala231位点进行了饱和突变，构建了含有57个突变体的库，并通过组合突变的方法寻找最佳的转氨酶突变体。通过比较产量和转化率，选择了Y168G突变体合成肉桂胺。最后，我们通过过表达zwf基因，为肉桂酸到肉桂醛合成提供所需要的辅因子NADPH，并通过优化辅因子PLP的浓度和氨基供体丙氨酸的浓度，在以肉桂酸钠为前体的条件下将肉桂胺的产量提升到523.15mg/L的水平。