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5-氨基乙酰丙酸(ALA)是合成四吡咯化合物的重要前体，在农业和医药领域具有广泛的应用。ALA的生物合成依赖于C4和C5两种途径，其中C5途径最早由本实验室研究者在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行构建，使谷氨酸通过三步酶促催化反应生成ALA。尽管已有较多代谢工程调控策略应用于ALA生物合成，但是对其生物合成途径关键酶的工程化及碳通量的优化仍有很大操作空间，这导致ALA产量进一步提升到达一个较难突破的瓶颈，需要我们进一步对途径碳通量进行精确平衡和优化。然而，精确调节碳通量较为复杂，ALA高产菌株较难筛选，因此迫切需要开发ALA响应性生物传感器作为高通量筛选工具进行应用。
本研究一方面通过多种策略代谢调控ALAC5途径谷氨酸节点提高ALA产量。为了增强内源谷氨酸合成途径，我们将icd(编码异柠檬酸脱氢酶)、gltBD(编码谷氨酸合酶)、gltA(编码柠檬酸合酶)、gdhA(编码谷氨酸脱氢酶)四个基因的启动子依此替换为iGEM(www.igem.org)库中最强启动子BBa_J23100。转入ALA发酵质粒验证发现仅替换icd基因的启动子使得ALA产量少许提高，证明了基因组上硬性调节的弊端和低效性。为了简化操作难度，我们又将icd、gdhA、acnB(编码乌头酸酶)三个基因进行过表达，这些基因的过表达均一定程度上提高了ALA的产量，其中过表达gdhA效果最佳，将ALA的产量提高70％左右，证明合理优化C5途径碳通量对ALA产量积累的有用性和潜力。另外，我们利用CRISPRi技术对谷氨酸分解途径的四个关键基因及sucA(编码α-酮戊二酸脱羧酶)进行抑制，并没有达到提高ALA产量的效果，而且双基因的同时抑制使得菌体生长产生了明显缺陷，证明单一抑制强度较难实现合理优化提高ALA产量。一系列结果表明ALA合成途径具有优化空间，但是缺乏用于动态调控和高产菌株筛选的工具，所以亟需开发ALA生物传感器。
另一方面是对ALA生物传感器进行设计与开发，包括基于转录因子(TF)的ALA生物传感器和基于嵌合双组分系统(TCS)的生物传感器的开发两部分内容。基于转录因子的ALA生物传感器开发部分，我们首先选择L-阿拉伯糖调节子AraC作为初始转录因子并利用计算机辅助对其进行理性设计与改造，得到19个AraC单位点突变体;然后对所有突变体进行ALA响应性表征和筛选，获得5个ALA响应性AraC单位点突变体;接着对响应性突变体进行组合突变并表征，获得3个ALA响应性AraC双位点突变体;最后对基于8个AraC突变体的ALA生物传感器进行ALA剂量响应性表征并确定相关性能参数，其中性能良好的ALA生物传感器可直接应用于ALA合成途径代谢工程中。
基于嵌合双组分系统的ALA生物传感器开发方面，我们选择了来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的化学感受器PctC与大肠杆菌来源的双组分系统EnvZ/OmpR进行嵌合。确定基于PctC/EnvZ嵌合体的生物传感器对γ-氨基丁酸(GABA)的响应性后，发现该嵌合体对ALA溶液酸性敏感。于是，我们又构建PctC与其他四种双组分系统的嵌合体，表征发现PctC/PhoQ嵌合体效果较好。在得到GABA响应性嵌合TCS的基础上对PctC感应域进行理性设计与改造，对所得突变体作为ALA生物传感器进行验证，初步确定ALA响应性突变体，并发现PctC/EnvZ、PctC/PhoQ两组嵌合体产生的ALA响应性突变体并不一致，证明两种嵌合体感应域的配体响应性存在差异。由于两种嵌合体系统本底荧光较高、存在泄露的问题，所以基于该系统的ALA生物传感器需要进行进一步的优化。
综上所述，本研究首先大肠杆菌中ALAC5途径进行优化，最高使得ALA产量提高70％，证明了合理优化、平衡碳通量的有用性及开发ALA生物传感器的必要性。接着对ALA生物传感器进行了设计与开发，得到了基于TF和嵌合TCS的ALA响应性生物传感器。其中基于转录因子AraC突变体的ALA生物传感器得到了良好表征可应用于ALA合成途径代谢工程中;而基于嵌合双足系统的生物传感器需要进一步的优化后进行应用。本论文对ALA生物传感器的设计开发是后续ALA生物传感器的优化和应用的关键起点，为其应用于ALA合成途径的调节优化和高产菌株的筛选奠定了基础。
本研究一方面通过多种策略代谢调控ALAC5途径谷氨酸节点提高ALA产量。为了增强内源谷氨酸合成途径，我们将icd(编码异柠檬酸脱氢酶)、gltBD(编码谷氨酸合酶)、gltA(编码柠檬酸合酶)、gdhA(编码谷氨酸脱氢酶)四个基因的启动子依此替换为iGEM(www.igem.org)库中最强启动子BBa_J23100。转入ALA发酵质粒验证发现仅替换icd基因的启动子使得ALA产量少许提高，证明了基因组上硬性调节的弊端和低效性。为了简化操作难度，我们又将icd、gdhA、acnB(编码乌头酸酶)三个基因进行过表达，这些基因的过表达均一定程度上提高了ALA的产量，其中过表达gdhA效果最佳，将ALA的产量提高70％左右，证明合理优化C5途径碳通量对ALA产量积累的有用性和潜力。另外，我们利用CRISPRi技术对谷氨酸分解途径的四个关键基因及sucA(编码α-酮戊二酸脱羧酶)进行抑制，并没有达到提高ALA产量的效果，而且双基因的同时抑制使得菌体生长产生了明显缺陷，证明单一抑制强度较难实现合理优化提高ALA产量。一系列结果表明ALA合成途径具有优化空间，但是缺乏用于动态调控和高产菌株筛选的工具，所以亟需开发ALA生物传感器。
另一方面是对ALA生物传感器进行设计与开发，包括基于转录因子(TF)的ALA生物传感器和基于嵌合双组分系统(TCS)的生物传感器的开发两部分内容。基于转录因子的ALA生物传感器开发部分，我们首先选择L-阿拉伯糖调节子AraC作为初始转录因子并利用计算机辅助对其进行理性设计与改造，得到19个AraC单位点突变体;然后对所有突变体进行ALA响应性表征和筛选，获得5个ALA响应性AraC单位点突变体;接着对响应性突变体进行组合突变并表征，获得3个ALA响应性AraC双位点突变体;最后对基于8个AraC突变体的ALA生物传感器进行ALA剂量响应性表征并确定相关性能参数，其中性能良好的ALA生物传感器可直接应用于ALA合成途径代谢工程中。
基于嵌合双组分系统的ALA生物传感器开发方面，我们选择了来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的化学感受器PctC与大肠杆菌来源的双组分系统EnvZ/OmpR进行嵌合。确定基于PctC/EnvZ嵌合体的生物传感器对γ-氨基丁酸(GABA)的响应性后，发现该嵌合体对ALA溶液酸性敏感。于是，我们又构建PctC与其他四种双组分系统的嵌合体，表征发现PctC/PhoQ嵌合体效果较好。在得到GABA响应性嵌合TCS的基础上对PctC感应域进行理性设计与改造，对所得突变体作为ALA生物传感器进行验证，初步确定ALA响应性突变体，并发现PctC/EnvZ、PctC/PhoQ两组嵌合体产生的ALA响应性突变体并不一致，证明两种嵌合体感应域的配体响应性存在差异。由于两种嵌合体系统本底荧光较高、存在泄露的问题，所以基于该系统的ALA生物传感器需要进行进一步的优化。
综上所述，本研究首先大肠杆菌中ALAC5途径进行优化，最高使得ALA产量提高70％，证明了合理优化、平衡碳通量的有用性及开发ALA生物传感器的必要性。接着对ALA生物传感器进行了设计与开发，得到了基于TF和嵌合TCS的ALA响应性生物传感器。其中基于转录因子AraC突变体的ALA生物传感器得到了良好表征可应用于ALA合成途径代谢工程中;而基于嵌合双足系统的生物传感器需要进一步的优化后进行应用。本论文对ALA生物传感器的设计开发是后续ALA生物传感器的优化和应用的关键起点，为其应用于ALA合成途径的调节优化和高产菌株的筛选奠定了基础。