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研究背景:最新的肿瘤流行病学的数据表明,肺癌已经成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最主要的病理类型,大约占85%以上。根据组织学分类定义,NSCLC主要分为肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）及肺鳞癌（Lung squamous carcinoma,LUSD）两大类型。其中,肺腺癌占所有肺癌的40%左右,肺鳞癌占25%左右。近年来,随着针对多种驱动基因的分子靶向药物的不断发展,含有特定基因突变的晚期NSCLC患者生存时间有所延长,但是肺癌患者总体五年生存率仍徘徊在15%。其中最重要的一个原因是肿瘤细胞的异常增殖和远处转移。环状核糖核酸是近年来肿瘤生物学研究领域的一个新热点。许多环状核糖核酸已被证明在肺腺癌的发展中起重要作用。在本研究中,我们研究了 hsa-circ-000881在LUAD中的表达情况以及临床预后价值,以及对肺腺癌侵袭、转移的影响及作用机制。本课题主要在以下几个主要方面进行研究:1、hsa-circ-000881在LUAD组织中的表达情况;2、hsa-circ-000881对肺腺癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭能力的影响;3、使用生物信息学分析hsa-circ-000881调控的下游miRNA,并分析其在LUAD组织中的表达情况;4、验证LUAD组织中hsa-circ-000881与靶向miRNA的共同表达情况;5、使用生物信息学分析找到miRNA下游调控的mRNA,并分析其在LUAD组织中的表达情况;6、验证LUAD组织中miRNA与靶向mRNA的共同表达情况;7、敲降hsa-circ-000881,检测下游靶 mRNA蛋白的表达;8、同时过表达hsa-circ-000881和miRNA,检测肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的变化;9、PRICKLE2在LUAD组织中的表达及与临床病理、预后相关性研究;10、PRICKLE2对肺腺癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭能力的影响;11、PRICKLE2对肺腺癌细胞周期及转移的影响;12、动物实验研究PRICKLE2调控肺腺癌增殖的作用;13、PRICKLE2调控MYC信号通路的机制研究。材料与方法:1.选取TCGA数据库中的LUAD数据集分析在肺腺癌组织中具有表达差异的环状RNA分子。hsa-circ-000881在肺腺癌组织中的相对表达通过RT-qPCR检测。选取A549与HCC-827细胞,使用CCK-8、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验分析hsa-circ-000881对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的影响。2.使用靶 点预测工具 Circular RNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）预测hsa-circ-000881靶向的miRNA,选择miR-665。利用TCGA公共数据库分析miR-665在LUAD中的表达情况。进行荧光素酶报告实验分析,以验证hsa-circ-000881与miR-665间的靶向关系。使用RT-qPCR检测miR-665在肺腺癌组织中的表达以及与hsa-circ-000881的共表达情况。3.使用靶点预测工具 Targetscan（http://www.targetscan.org/vert72/）预测 miR-665 靶向的 mRNA,选择PRICKLE2。利用TCGA公共数据库分析PRICKLE2在LUAD中的表达及对预后的影响。进行荧光素酶报告实验分析,以验证PRICKLE2与miR-665间的靶向关系。使用RT-qPCR检测PRICKLE2在肺腺癌组织中的表达以及与miR-665的共表达情况。4.敲降 hsa-circ-000881,检测 PRICKLE2 蛋白的表达;同时过表达 hsa-circ-000881 和 miR-665,使用平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验分析A549与HCC-827细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化;同时过表达hsa-circ-000881和敲降PRICKLE2,使用平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验分析A549与HCC-827细胞增殖、迁移和侵袭的变化。5、在TCGA公共数据库中分析PRICKLE2的表达情况及预后意义。利用Western blot及免疫组化（IHC）的方法在LUAD及配对癌旁组织中检测PRICKLE2的蛋白表达情况。6.在低表达PRICKLE2的2株肺腺癌细胞株（NCIH1395,NCIH1975）中,通过质粒转染方式过表达PRICKLE2,并用Western blot验证其转染效率,运用CCK-8实验、EdU实验检测细胞生长和增殖的变化。流式检测细胞周期,并使用Western blot检测周期相关蛋白（Cyclin D1与P21）的变化,探究过表达PRICKLE2对细胞周期的影响。7.运用慢病毒感染构建稳定过表达PRICKLE2的NCIH1395细胞株,分成两组（NCIH1395空白组和OE-PRICKLE2细胞组）。构建裸鼠皮下瘤模型,观察两组皮下瘤生长的速度、肿瘤体积及增殖凋亡相关指标的表达等。8.运用Transwell迁移实验检测PRICKLE2过表达后细胞迁移能力的变化,并进一步运用Western blot方法检测凋亡蛋白指标的改变。9.对TCGA中LUAD的表达数据进行GSEA分析,得到PRICKLE2相关的下游通路,选择MYC通路进行后续分析。检测MYC与PRICKLE2在TCGA的LUAD中的共同表达情况。在NCIH1395和NCIH1975细胞中过表达PRICKLE2,使用Western blot方法验证MYC通路相关基因（MYC、NOLC1、NPM1以及MCM5）变化。10.在NCIH1395细胞中过表达PRICKLE2,使用Western blot检测MYC蛋白的表达情况,运用CCK-8实验、EdU实验、Transwell迁移实验、细胞周期实验检测细胞生长、增殖、迁移以及周期的变化。实验结果:1、通过分析发现hsa-circ-000881在LUAD组织中表达显著下调。2、敲降hsa-circ-000881可以增强LUAD细胞的生长、迁移和侵袭能力。3、荧光素酶报告基因实验和生物信息学分析的结果表明hsa-circ-000881对miR-665具有吸附作用,而PRICKLE2是miR-665的直接靶标。4、过表达miR-665或沉默PRICKLE2可以逆转hsa-circ-000881过表达对LUAD细胞增殖、迁移的抑制作用。5、通过分析TCGA-LUAD数据发现PRICKLE2在LUAD中下调,与LUAD患者的生存期显著相关。通过Western blot及IHC发现其在癌组织中的表达明显下调。6、在肺腺癌细胞株（NCIH1395,NCIH1975,A549,PC9和H1299）中、运用Western blot方法检测PRICKLE2表达水平,结果表明PRICKLE2在2株肺腺癌细胞系（NCIH1395和NCIH1975）呈现低表达。通过质粒感染的方式在NCIH1395和NCIH1975细胞株中过表达PRICKLE2,并用Western blot验证其转染效率,结果表明PRICKLE2表达明显上升。细胞增殖及周期实验表明,在A549和NCIH1975细胞株中运用MTT和EdU实验检测发现过表达PRICKLE2后细胞生长能力明显减弱;细胞周期实验表明的过度表达PRICKLE2导致NCIH1395和NCIH1975细胞的G1期细胞周期阻滞。此外,Western blot结果显示,细胞周期标记物cyclin D1被下调,而p21在PRICKLE2过表达时被上调。7、将PRICKLE2稳定过表达的NCIH1395细胞注射裸鼠皮下,6天后开始观察裸鼠皮下瘤生长情况,至第21天,与对照组相比,OE-PRICKLE2组的皮下瘤体积明显减小。并随时间的延长,两组间的差异逐渐增大。H＆E染色、Ki67染色及Tunnel染色结果进一步发现PRICKLE2过表达后,小鼠的肺癌细胞的增殖明显受到抑制,且细胞凋亡率显著上升。8、Transwell迁移实验表明过表达PRICKLE2后细胞的迁移能力明显减弱。此外,Western blot结果显示,PRICKLE2的过表达使得E-cadherin表达升高,N-cadherin和Vimentin表达降低。9、TCGA-LUAD数据分析结果表明PRICKLE2与MYC的表达呈负相关。Western blot结果显示,PRICKLE2的过度表达导致MYC、NOLC1、NPM1以及MCM5蛋白表达下降。10、CCK-8实验、EdU实验、Transwell迁移实验、细胞周期实验结果表明MYC的过度表达可以消除PRICKLE2对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论:1、hsa-circ-000881在LUAD组织中显著下调。2、hsa-circ-000881 通过 MiR-665/PRICKLE2 轴对 LUAD 具有抑制作用,这表明 hsa-circ-000881可能是LUAD的潜在治疗靶点。3、PRICKLE2在LUAD组织中下调并与LUAD的不良预后密切相关。4、在体外实验结果表明PRICKLE2可抑制肺腺癌细胞增殖和迁移能力并对细胞周期产生G1期阻滞。5、在动物体内PRICKLE2也可抑制肺腺癌细胞的增殖。6、PRICKLE2可以通过抑制MYC通路,抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭,进而抑制LUAD病程的进展。