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第一部分 通过RNA-seq数据的生物信息学分析确定颈动脉粥样硬化的关键途径和基因研究背景动脉粥样硬化（AS）导致的心肌梗死、缺血性脑卒中等疾病位居人类各种致死病因的首位,是造成过早死亡和疾病负担的首位原因,其高致死率和致残率已引发重大的医疗和社会经济问题。如何抑制延缓AS的形成,降低AS性心脑血管疾病的发生率和死亡率已成为该领域共同努力的目标。动脉粥样硬化（AS）是缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗死和外周血管疾病的主要病理基础[1],其发生发展是由慢性炎症和自身免疫等参与的多因素、多步骤、多阶段进展的复杂事件,目前预防动脉粥样硬化的药物主要集中在减轻炎症和降低血脂以及手术治疗。如何对动脉粥样硬化进行早期诊断及治疗干预,防止病变进展,成为防治该病的主要策略。因此进一步探索动脉粥样硬化的发生发展机制,在基因水平寻找早期有效的防治靶点迫在眉睫。转录组测序技术（RNA-seq）是一种强大的基因探索手段,用于阐明疾病的发生机制。在这项研究中,我们对颈动脉粥样硬化（CAS）患者和健康人的动脉内膜组织进行了 RNA-seq分析。筛选出与CAS相关的差异表达的基因（DEGS）,并对DEG进行了多种功能分析（包括GO,KEGG和MCODE富集分析）。结果表明,DEG主要集中在与炎症和免疫相关的生物学途径中。通过构建蛋白互作网络（PPI）来筛选20个Hub基因。生物信息学分析表明,与AS相关的Hub基因主要富集在肺部,其核心转录因子是Rela和NFKB1,而且它们涉及多种生物过程和疾病发展。CMAP数据库确定了三种与Hub基因相互作用的小分子化合物:Ceforanide,Chenodeoxycholic acid和0317956-0000,它们可以靶向调控AS相关的Hub基因,有望成为治疗AS的靶向药物。该研究将RNA-seq与生物信息学结合,探讨AS的发病机制和潜在的治疗方法。研究目的本研究对颈动脉粥样硬化与正常动脉内膜组织行RNA-Seq测序,分析差异基因表达谱,并结合生物信息学的研究分析,筛选动脉粥样硬化相关的关键途径和基因,探索动脉粥样硬化的潜在机制及潜在治疗靶点。研究方法1.收集标本送检测序,测序数据质控。收集颈动脉粥样硬化患者血管内膜及既往健康的外伤患者动脉内膜,送检诺禾致源公司行转录组测序（RNA-Seq）。使用TRIzol法提取RNA,经文库构建、质检符合预期后行Illumina测序。数据质控,对原始数据进行过滤,并使用HISAT2软件将质控后的clean reads比对到人的参考基因组上,得到满意的测序数据。基因表达分布及定量分析符合预期要求。2.差异基因GO和KEGG pathway分析首先通过org.Hs.eg.db包将差异基因的Official Symbol转化为基因ID;用clusterProfiler包进行GO和KEGG pathway分析,使用GOplot包进行聚类分析,以adj.P.Val＜0.05为有显著差异。3.差异基因的MCODE分析将差异基因通过Metascape在线数据库进行MCODE分析,并对每个MCODE进行KEGG pathway富集分析。4.PPI网络构建及Hub基因筛选使用STRING数据库构建PPI网络,大于0.9的组合分数的相互作用被认为是统计学上显着的。使用Cytoscape软件对PPI网络进行优化。安装CytoHubba插件,按degree方法筛选前20的hub基因。5.Hub基因的生物信息学分析将Top20 hub基因通过Metascape在线数据库进行分析。通过CMAP在线数据库预测与hub基因作用的小分子药物。研究结果1.测序数据的基础分析经过原始数据过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查等过程,获得后续分析使用的clean reads,动脉粥样硬化样本 ASA-1、ASA-2 分别获得 57.14、72.0 million clean reads;正常对照样本 NA-1、NA-2 和 NA-3 分别获得 59.84、70.13、61.10 million clean reads。将质控后的clean reads 比对到人参考基因组上,ASA-1、ASA-2 total Mapped Reads分别为96.08、94.70%;NA-1、NA-2 和 NA-3 total Mapped Reads 分别为 94.95、96.28 和 95.99%。2.基因表达分布及差异基因分析盒形图和密度图展示出不同样本基因表达水平分布均一,说明测序数据质量较高,差异性较小。样品间基因表达相关性结果表明测序数据可靠以及样本选择合理;主成分分析（PCA）表明组间样本分散,组内样本聚在一起;我们对测序进行归一化处理后,进行热图绘制,筛选差异基因（DEGs）,总共筛选到1427个差异基因,其中710个上调,717个下调。3.差异基因GO和KEGG富集分析GO分析结果表明,这些靶点的生物学过程（BP）主要显著富集在白细胞迁移、白细胞激活的调节、炎性反应的调节等;细胞组分（CC）主要显著富集在细胞外基质、质膜蛋白复合物、突触膜等;分子功能（MF）主要显著富集在金属离子跨膜转运活性、底物特异性通道活性、酰胺结合等（图4A）。KEGG通路分析表明这些靶点主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子等（图4B）。4.差异基因的MCODE分析分析发现差异基因被分成1 8个模块,并分别对模块1到模块18进行KEGG富集分析,模块1主要富集在神经刺激配体-受体交互作用,模块2富集在cAMP信号通路和模块3富集在趋化因子信号通路等等（表4）。5.PPI网络构建及Hub基因筛选差异基因通过STRING online database构建PPI网络,并用cytoscape软件对PPI网络进行优化。使用cytoHubba的degree方法筛选Hub基因,排在前20的基因被鉴定为Hub基因（关键基因）。6.Hub基因生物信息学分析对20个hub基因在Metascape数据库进行富集分析,结果发现20个hub基因主要富集在G alpha（i）信号事件、GPCR配体结合、神经活性配体与受体的相互作用等（图7A）。TRRUST数据库转录因子富集分析显示调控hub基因的主要转录因子为RELA和NFKB1（图7B）.DisGeNET数据库疾病富集分析显示hub基因也参与Depressive disorder（抑郁症）、Mental Depression（精神抑郁）)和 Alcoholic Intoxication（酒精中毒）,Chronic（慢性病）等（图7C）。PaGenBase数据库组织特性富集分析显示hub基因主要富集在肺（图7D）。CMAP 数据库分析发现 ceforanide、chenodeoxycholic acid 和 0317956-0000 可以负调控 hub基因（表5）,这三种小分子化合物可以作为治疗动脉粥样硬化的候选药物。结论1.本研究用R包（DESeq2）对测序数据集进行分析,筛选出差异基因（DECs）1427个,其中710个上调,717个下调。这表明动脉的粥样病变伴随着多个基因的调控异常。2.用GO和KEGG对DEGs的功能进行富集分析,发现这些DEGs的表达变化可能会影响与炎症、免疫反应密切相关的信号传导途径,如细胞因子介导的信号传导和炎症反应等。3.MCODE分析DEGs,根据功能可将DEGs分为18个模块,这意味着这些DEGs在AS的病变过程中发挥着不同的功能,每个模块基因的调控相互联系,可见AS的病理机制十分复杂,涉及神经系统的配体受体相互作用、cAMP信号通路、趋化因子信号通路等多种生物过程。4.对差异基因构建PPI网络,使用cytoHubba的degree方法筛选与动脉粥样硬化相关的 20 个 Hub 基因。通过 CMAP 数据库筛选出了 ceforanide、chenodeoxycholic acid 和0317956-0000三种可与Hub基因相互作用的小分子化合物,提示这些小分子化合物有治疗动脉粥样硬化的潜在的价值。意义本研究利用RNA-seq技术结合网络药理学分析研究了 AS的潜在靶标,发现了 20个Hub基因和3个治疗AS的候选小分子化合物,为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供新的思路。第二部分探索SAA1通过p38MAPK信号通路对巨噬细胞THP-1的作用及机制研究背景动脉粥样硬化（AS）的形成包括氧化应激、炎性细胞聚集、内皮功能障碍、低密度脂蛋白（LDL）氧化、泡沫细胞形成和血管平滑肌细胞增殖和迁移等参与的多因素、多步骤、多阶段进展的复杂事件。医学界对动脉粥样硬化的研究已有上百年历史,目前关于AS发病机制的主要学说包括内皮损伤反应、脂质浸润、炎性反应、血栓形成、平滑肌细胞克隆、剪切应力、免疫以及细胞焦亡等方面。但AS具体发病机制尚未完全探明,随着医学分子生物学和基因诊断技术的快速发展及临床应用,从分子和基因水平上探索AS的发生发展机制,并探索新的治疗靶点已成为缺血性心脑血管病领域研究的热点。前期研究,我们通过转录组测序技术（RNA-seq）对颈动脉粥样硬化（CAS）患者和健康人动脉内膜组织进行了 RNA-seq分析,结合生物学信息分析,筛选动脉粥样硬化患者较健康人表达明显的差异基因,并进一步鉴定出了与动脉粥样硬化相关的20个Hub基因,其中SAA1、GNG8和LPAR2级别最高（相关性最强）。我们使用低密度氧化脂蛋白（ox-LDL）处理THP-1衍生的巨噬细胞,使用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测SAA1、GNG8和LPAR2正常THP-1巨噬细胞和ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞的表达,选择差异表达最显著的SAA1进行后续研究。SAA1主要编码急性期人血清淀粉样蛋白A（A-SAA）,A-SAA是一种急性时相反应蛋白,在机体受到炎性或免疫等刺激时,可由SAA1急性表达,然后在肝脏及脂肪组织大量合成并分泌到血液中。A-SAA具有多种生物学功能,可以促进炎性细胞黏附、迁移及浸润等,抑制免疫反应、结合高密度脂蛋白影响胆固醇代谢以及诱导多种基质金属蛋白酶的表达,广泛参与炎症、免疫、脂质代谢、心脑血管疾病、肿瘤等疾病的调节。我们拟通过细胞实验研究SAA1对AS发生过程中重要参与者巨噬细胞的炎性反应和氧化应激的影响,并探讨其可能的机制,以期为动脉粥样硬化的预防和治疗提供一个新的靶点。研究目的1.使用ox-LDL孵育THP-1构建动脉粥样硬化THP-1巨噬细胞模型。2.对RNA-seq测序筛选出的Hub基因行表达量验证,筛选表达差异最明显的SAA1进行下一步研究。3.在THP-1巨噬细胞模型中分别干扰和过表达SAA1,研究其对THP-1巨噬细胞模型表达炎性细胞因子（TNFa、IL-6）及参与氧化应激的细胞因子（iNOS、ROS、MDA、SOD）的影响。4.通过检测通路蛋白的表达,探索SAA1影响THP-1巨噬细胞可能的机制,并通过加入通路蛋白抑制剂后再次检测上述炎性因子和细胞因子的变化,验证Hub基因SAA1影响THP-1巨噬细胞的信号通路。5.本研究旨在探索Hub基因SAA1对THP-1巨噬细胞的作用及机制,探讨SAA1在动脉粥样硬化发生发展中的作用及机制,拟为动脉粥样硬化的预防和治疗提供新的治疗靶点。研究方法1.构建动脉粥样硬化THP-1细胞环境（细胞模型）实验组使用ox-LDL孵育THP-1构建动脉粥样硬化细胞模型,加入ox-LDL构建AS细胞生长环境;无特殊处理的THP-1作为对照组。我们采用浓度分别为0,6.25,12.5,25,50,100,150 ug/mL的ox-LDL干预巨噬细胞（THP-1）,CCK-8细胞增殖实验检测不同浓度ox-LDL对THP-1细胞增殖能力的影响。2.Hub基因在THP-1细胞模型的表达量验证采用RT-qPCR技术检测与动脉粥样硬化相关性最强的三种Hub基因SAA1、GNG8和LPAR2在THP-1实验组与对照组间的表达差异,筛选差异表达最显著的SAA1进行后续研究。3.转染hub基因后检测炎性因子和细胞因子的变化分别将SAA1-mimic和inhibitor转染THP-1巨噬细胞,拟设组别为:正常组（THP-1）、模型组（THP-1 ox-LDL孵育）、模型+空载组（THP-1 ox-LDL孵育+SAA1-NC）、模型+SAA1过表达组（THP-1 ox-LDL 孵育+SAA1 mimic）、模型+si-NC（THP-1 ox-LDL 孵育+Si-NC）、模型+si-SAA1（THP-1 ox-LDL孵育+Si-SAA1）。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组细胞中TNFa、IL6、iNOS、ROS、MDA及SOD等AS相关炎性因子和细胞因子的变化。4.转染hub基因后检测通路蛋白的变化,研究其可能的机制分别将SAA1-mimic和inhibitor转染THP-1巨噬细胞,提取各组蛋白,Western blot检测各组p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及其活化形式磷酸化p38MAPK（P-p38 MAPK）蛋白的变化。5.加入通路蛋白抑制剂后检测炎性因子和细胞因子的变化,进一步验证其机制转染SAA1时加入p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580,拟设组别为:（1）正常组、（2）模型组、（3）模型+空载、（4）模型+SAA1过表达、（5）模型+SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染SAA1后THP-1细胞中TNFa、IL6、iNOS、ROS、MDA及SOD等AS相关炎性因子和细胞因子的变化。研究结果1.使用ox-LDL孵育THP-1构建动脉粥样硬化细胞模型实验结果提示ox-LDL可以有效抑制THP-1细胞增殖能力,ox-LDL浓度达到50 ug/mL时可明显抑制THP-1细胞增殖（抑制率60.5%,且显微镜下观察泡沫细胞形成满意）,我们选择ox-LDL的干预浓度选择50 ug/mL,干预时间为24h。2.表达量验证——RT-qPCR检测SAA1、GNG8和LPAR2在实验组和对照组中的表达量采用RT-qPCR检测与动脉粥样硬化相关性最强的三种Hub基因SAA1、GNG8和LPAR2在THP-1模型组与正常对照组间的表达差异,结果SAA1、GNG8和LPAR2在模型组与正常对照组的表达比率分别为3.69（P＜0.01）、2.15（P＜0.01）、1.95（P＜0.01）,本研究中可以看出SAA1、GNG8和LPAR2三种Hub基因在50 ug/mL的ox-LDL孵育的THP-1细胞中表达均明显上调,其中以SAA1差异表达最显著,所以选择SAA1进行后续研究。3.酶联免疫吸附实验（ELISA）检测炎性因子和细胞因子分别将SAA1-mimic和inhibitor转染THP-1巨噬细胞,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染SAA1后THP-1细胞中TNFa、IL6、iNOS、ROS、MDA及SOD等AS相关炎性因子和细胞因子的变化。结果发现ox-LDL孵育的THP-1巨噬细胞转染SAA1后:炎性细胞因子TNFa（ug/mL）表达上调:（模型组:145.45±15.21,SAA1过表达组:247.45±12.96）（P＜0.005）;炎性细胞因子IL6（ug/mL）表达上调:（模型组:147.60± 10.38,SAA1过表达组:247.45±12.96）（P＜0.005）;具有氧化作用的iNOS（U/mL）表达上调:（模型组:33.82±3.99,SAA1过表达组:57.68±4.01）（P＜0.005）;具有氧化作用的ROS（ug/mL）表达上调:（模型组:5.70±1.23,SAA1过表达组:10.16±1.32）（P＜0.005）;代表氧化损伤的MDA（nmol/L）表达上调:（模型组:12.22±0.71,SAA1过表达组:20.64±1.29）（P＜0.005）;具有抗氧化作用的细胞因子SOD（U/mL）表达下调:（模型组:6.15±0.81,SAA1过表达组:3.19±0.53）（P＜0.005）。以上结果表明SAA1可能通过刺激炎症反应和氧化应激等发挥促动脉粥样硬化作用。4.Western blot检测通路蛋白的变化。Western blot检测干扰组与正常组p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及其活化形式磷酸化p38MAPK（P-p38 MAPK）蛋白的变化。模型组与正常组相比,p-p38蛋白表达明显上调（P＜0.005）;与模型组比较,SAA1 mimic（过表达组）p-p38蛋白表达明显上调（P＜0.005）,而Si-SAA1组p-p38蛋白表达明显下调（P＜0.005）。SAA1过表达组p-p38蛋白表达能力明显提高,表明SAA1可以通过激活p38MAPK信号通路发挥促进动脉粥样硬化过程中炎性反应及氧化应激的作用。5.抑制p38MAPK后检测炎性因子和细胞因子的变化转染SAA1时加入p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染SAA1后THP-1细胞中TNFa、IL6、iNOS、ROS、MDA及SOD等AS相关炎性因子和细胞因子的变化,SAA1过表达组加入p38 MAPK信号通路抑制后与SAA1过表达组相比:炎性细胞因子TNFa（ug/mL）表达下调:（SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂组:152.82±8.04,SAA1 过表达组:237.43±12.36）（P＜0.005）;炎性细胞因子IL6（ug/mL）表达下调:（SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂组:153.77±6.86,SAA1 过表达组:220.84±10.99）（P＜0.005）;具有氧化作用的iNOS（U/mL）表达下调:（SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂组:30.91±2.04,SAA1 过表达组:50.91±3.82）（P＜0.005）;具有氧化作用的ROS（ug/mL）表达下调:（SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂组:6.85±0.72,SAA1 过表达组:10.71±0.76）（P＜0.005）;代表氧化损伤的MDA（nmol/L）表达下调:（SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂组:13.77±1.06,SAA1 过表达组:22.14±1.25）（P＜0.005）;具有抗氧化作用的细胞因子SOD（U/mL）表达上调:（SAA1过表达+p38MAPK通路抑制剂组:6.25±0.48,SAA1 过表达组:3.29±0.39）（P＜0.005）;p38 MAPK信号通路抑制SB203580可以明显抑制SAA1的促炎和促氧化作用,表明抑制p38 MAPK信号通路或抑制SAA1表达可以抑制THP-1巨噬细胞的炎症反应及氧化作用。结论1.我们通过RNA-seq测序,筛选的Hub基因SAA1在ox-LDL孵育的THP-1动脉粥样硬化细胞模型中表达明显升高。2.SAA1可能通过促进THP-1巨噬细胞炎症反应和氧化应激等发挥促动脉粥样硬化作用。3.SAA1对THP-1巨噬细胞的作用是通过p38 MAPK信号通路完成的,p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580可以有效抑制SAA1对THP-1介导的炎症反应和氧化应激作用。意义本课题证实了 SAA1可以促进THP-1巨噬细胞中炎性细胞因子（TNFa、IL6）及参与氧化应激的细胞因子（iNOS、ROS、MDA）的表达,抑制具有抗氧化作用的细胞因子SOD的表达,表明SAA1可能通过刺激炎症反应和氧化应激等发挥促动脉粥样硬化作用。机理研究表明,SAA1对THP-1巨噬细胞的作用是通过p38 MAPK信号通路完成的,p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580可以有效抑制SAA1的上述作用。抑制SAA1有望成为防治动脉粥样硬化新的治疗靶点。