论文部分内容阅读
真菌病害严重影响农业生产，潜在威胁食品安全和人类健康。柑橘采后储运与销售阶段易发生多种真菌病害。指状青霉(绿霉)、意大利青霉(青霉)和皮落青霉引发柑橘腐烂，导致采后损失严重，是制约柑橘产业发展的主要病原真菌。与青绿霉相比，皮落青霉宿主广泛，除柑橘外还感染多种瓜果和食品加工原料，危害更广。甾醇去甲基化酶抑制剂(DMI)类化学药物如咪鲜胺广泛用于真菌病害防控，但是抗药菌株频繁出现，药效逐渐下降。皮落青霉咪鲜胺抗性显著高于青绿霉菌，相对低抗菌株少。青绿霉咪鲜胺抗性机制已有比较转录组学研究，但皮落青霉由于缺乏抗性合适的对照菌株而未见报道。真菌病毒普遍存在于柑橘青绿霉菌，导致宿主毒力或抗药性下降，即产生弱毒或“药物条件弱毒”菌株。染毒真菌抗性降低可作为抗药机制研究的必要材料。研究皮落青霉病毒及其对宿主的抗药调控，为真菌病毒研究提供新资料，有助于深入认识青霉属病原真菌抗药机制和药物条件弱毒机制。
本研究以两株咪鲜胺抗性水平显著差异的皮落青霉高抗菌株(CQl和CQl5)为材料，运用转录组结合RT-qPCR解析咪鲜胺抗性基因及其作用机制。分离鉴定皮落青霉病毒并研究其对宿主真菌咪鲜胺抗性的影响。构建皮落青霉人工染毒菌株CQlV。进一步运用转录组结合RT-qPCR比较CQlV、CQl以及病毒自然宿主CQl5在咪鲜胺施药下的基因转录模式，鉴定病毒参与宿主抗药调控的靶基因及其功能。获得下列主要研究结果。
1.转录组解析皮落青霉咪鲜胺抗性机制
以咪鲜胺抗性差异显著的皮落青霉菌CQ和CQ15为材料，转录组测序与生物信息学解析咪鲜胺抗性基因及其综合代谢背景。根据两者基因表达模式差异，运用COG、KOG、GO和KEGG数据库富集分类技术，筛选获得皮落青霉抗药基因包括CYP51靶标酶基因、MFS和ABC药泵蛋白基因、细胞色素b5基因、甾醇生物合成关键酶基因(ERG3、ERG4、ERG5、ERG1l、ERG24和ERG27)、脂肪酸代谢关键酶基因、细胞壁多糖代谢基因、GSH抗氧化损伤相关酶基因以及细胞呼吸、氧化磷酸化关键酶基因。RT-qPCR验证了上述DEG的差异表达模式。证明皮落青霉咪鲜胺抗性机制不仅包括P450、药泵蛋白等传统靶标基因，还涉及以细胞膜抗逆反应如GSH抗氧化损伤为中心的碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢调控。为生物学功能实验深入研究青霉属病原真菌DMI抗性机制提供了重要的线索。
2.皮落青霉病毒分离、鉴定与咪鲜胺抗性调控作用
从咪鲜胺抗性相对较低的皮落青霉菌CQl5中分离获得一株双链(ds)RNA病毒，运用高通量测序结合随机引物PCR克隆了全部四个节段的病毒基因组dsRNA。病毒基因组包括四个节段(dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3和dsRNA4)，全长依次为3600、3177、3078和2808bp。它们各自包含～个开放阅读框，依次编码依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp，含1113个氨基酸残基)、衣壳蛋白(CP，含981个氨基酸残基)和两个未定功能的蛋白质(分别包含912和847个氨基酸残基)。根据RdRp序列同源比对结果构建分子进化树证明该病毒属于产黄病毒科和产黄病毒属，命名为Penicillium crustosum chrysovirus l(PcCV1)。这是第一例皮落青霉dsRNA病毒，为产黄科病毒家族增加了新成员。制备CQl5的PcCV1脱毒株CQ15c，证明CQ15C咪鲜胺抗性(EC50=4.6±0.3mg·L。)高于CQ15(EC50=2.5±0.4mg·L-1)。构建了皮落青霉人工染毒株CQlV，证明CQlV咪鲜胺抗性(EC50=5.9±0.6mg·L-1)低于CQI(10.5±1.9mg·L-1)。表明PcCV1导致宿主真菌药物条件弱毒，即病毒感染可以增强咪鲜胺对皮落青霉的防控效率。
3.转录组解析皮落青霉病毒调控宿主咪鲜胺抗性机制
运用转录组测序与生物信息学解析CQ1V与未染毒亲本CQ1咪鲜胺处理条件下的基因表达模式，比较了CQ1V和病毒自然宿主CQ15施药条件下的基因表达模式以及不施药条件下抗性基因的本底表达模式。根据基因表达模式差异，运用COG、KOG、GO和KEGG富集分类技术结合RT-qPCR证明PcCV1具有抑制咪鲜胺对皮落青霉抗药基因的诱导作用，即削弱了宿主对药物胁迫的适应能力。药物诱导作用被病毒削弱的抗性基因包括CYP51靶标酶、MFS和ABC药泵蛋白、细胞色素b5、甾醇生物合成关键酶以及细胞膜抗逆相关碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢酶及转运蛋白基因。证明PcCV1通过调控宿主的咪鲜胺抗性基因而导致药物条件弱毒。
综上所述，本研究采用转录组结合真菌病毒解析皮落青霉眯鲜胺抗性机制，在综合代谢层面揭示了皮落青霉普遍高抗的分子机制，为深入认识青霉属病原真菌抗药机制以及真菌病毒参与抗药调控提供了新的转录组证据，为新靶标真菌药物设计提供必要的理论依据。
本研究以两株咪鲜胺抗性水平显著差异的皮落青霉高抗菌株(CQl和CQl5)为材料，运用转录组结合RT-qPCR解析咪鲜胺抗性基因及其作用机制。分离鉴定皮落青霉病毒并研究其对宿主真菌咪鲜胺抗性的影响。构建皮落青霉人工染毒菌株CQlV。进一步运用转录组结合RT-qPCR比较CQlV、CQl以及病毒自然宿主CQl5在咪鲜胺施药下的基因转录模式，鉴定病毒参与宿主抗药调控的靶基因及其功能。获得下列主要研究结果。
1.转录组解析皮落青霉咪鲜胺抗性机制
以咪鲜胺抗性差异显著的皮落青霉菌CQ和CQ15为材料，转录组测序与生物信息学解析咪鲜胺抗性基因及其综合代谢背景。根据两者基因表达模式差异，运用COG、KOG、GO和KEGG数据库富集分类技术，筛选获得皮落青霉抗药基因包括CYP51靶标酶基因、MFS和ABC药泵蛋白基因、细胞色素b5基因、甾醇生物合成关键酶基因(ERG3、ERG4、ERG5、ERG1l、ERG24和ERG27)、脂肪酸代谢关键酶基因、细胞壁多糖代谢基因、GSH抗氧化损伤相关酶基因以及细胞呼吸、氧化磷酸化关键酶基因。RT-qPCR验证了上述DEG的差异表达模式。证明皮落青霉咪鲜胺抗性机制不仅包括P450、药泵蛋白等传统靶标基因，还涉及以细胞膜抗逆反应如GSH抗氧化损伤为中心的碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢调控。为生物学功能实验深入研究青霉属病原真菌DMI抗性机制提供了重要的线索。
2.皮落青霉病毒分离、鉴定与咪鲜胺抗性调控作用
从咪鲜胺抗性相对较低的皮落青霉菌CQl5中分离获得一株双链(ds)RNA病毒，运用高通量测序结合随机引物PCR克隆了全部四个节段的病毒基因组dsRNA。病毒基因组包括四个节段(dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3和dsRNA4)，全长依次为3600、3177、3078和2808bp。它们各自包含～个开放阅读框，依次编码依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp，含1113个氨基酸残基)、衣壳蛋白(CP，含981个氨基酸残基)和两个未定功能的蛋白质(分别包含912和847个氨基酸残基)。根据RdRp序列同源比对结果构建分子进化树证明该病毒属于产黄病毒科和产黄病毒属，命名为Penicillium crustosum chrysovirus l(PcCV1)。这是第一例皮落青霉dsRNA病毒，为产黄科病毒家族增加了新成员。制备CQl5的PcCV1脱毒株CQ15c，证明CQ15C咪鲜胺抗性(EC50=4.6±0.3mg·L。)高于CQ15(EC50=2.5±0.4mg·L-1)。构建了皮落青霉人工染毒株CQlV，证明CQlV咪鲜胺抗性(EC50=5.9±0.6mg·L-1)低于CQI(10.5±1.9mg·L-1)。表明PcCV1导致宿主真菌药物条件弱毒，即病毒感染可以增强咪鲜胺对皮落青霉的防控效率。
3.转录组解析皮落青霉病毒调控宿主咪鲜胺抗性机制
运用转录组测序与生物信息学解析CQ1V与未染毒亲本CQ1咪鲜胺处理条件下的基因表达模式，比较了CQ1V和病毒自然宿主CQ15施药条件下的基因表达模式以及不施药条件下抗性基因的本底表达模式。根据基因表达模式差异，运用COG、KOG、GO和KEGG富集分类技术结合RT-qPCR证明PcCV1具有抑制咪鲜胺对皮落青霉抗药基因的诱导作用，即削弱了宿主对药物胁迫的适应能力。药物诱导作用被病毒削弱的抗性基因包括CYP51靶标酶、MFS和ABC药泵蛋白、细胞色素b5、甾醇生物合成关键酶以及细胞膜抗逆相关碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢酶及转运蛋白基因。证明PcCV1通过调控宿主的咪鲜胺抗性基因而导致药物条件弱毒。
综上所述，本研究采用转录组结合真菌病毒解析皮落青霉眯鲜胺抗性机制，在综合代谢层面揭示了皮落青霉普遍高抗的分子机制，为深入认识青霉属病原真菌抗药机制以及真菌病毒参与抗药调控提供了新的转录组证据，为新靶标真菌药物设计提供必要的理论依据。