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Ap2是一种异四聚体网格蛋白接头复合物,在囊泡形成及识别其运载物质的过程中发挥重要作用。细胞壁完整性(Cell wall integrity,CWI)通路是控制真菌生长发育、致病和适应环境胁迫的重要途径。迄今为止,在植物病原真菌中Ap2复合体和CWI之间的关系尚未研究。本团队前期解析了禾谷镰刀菌中CWI信号途径的功能。为此,本文进一步研究了FgAp2复合体与CWI信号途径之间的关系。根据酿酒酵母中Ap2各亚基的蛋白序列,鉴定了禾谷镰刀菌中FgAp2复合体的四个亚基分别为FgAp2α、FgAp2β、FgAp2σ和FgAp2μ。通过同源重组基因敲除技术,获得四个亚基的基因缺失突变体。表型测定发现,四个亚基突变体的菌丝生长速率明显降低,致病力显著下降。细胞壁水解酶和透射电镜切片试验发现,四个突变体细胞壁完整性显著受损。酵母双杂和蛋白定位试验表明,FgAp2μ与CWI信号途径上游受体蛋白FgWsc2b直接互作,并影响FgWsc2b的细胞定位,在FgAP2μ基因缺失突变体(ΔFgAp2μ)中FgWsc2b在细胞膜出现累积并且大量定位在液泡上。蛋白免疫印迹试验进一步发现,FgAp2μ能正调节CWI途径下游关键激酶FgMgv1磷酸化。综上,FgAp2μ通过转运CWI信号途径的受体蛋白FgWsc2b,进而调控病菌生长和致病等重要性状。
枯草杆菌蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶家族中的一类重要蛋白酶,参与生物体多项生命活动。然而,在植物病原真菌中尚未对该类蛋白酶进行系统研究。本文鉴定了禾谷镰刀菌中32个枯草杆菌蛋白酶基因,通过同源重组基因敲除技术获得所有基因缺失突变体。生长表型测定发现,32个突变体中仅FgPRB1基因缺失突变体(ΔFgPrb1)表现出生长缺陷。同样,致病性测定发现,仅有ΔFgPrb1在麦穗、胚芽鞘、小麦叶片和玉米须上的致病力均显著下降。毒素测定发现ΔFgPrb1中DON毒素合成减少,毒素合成相关基因的表达量降低。本研究发现FgPrb1通过高渗透性甘油信号途径(High osmolarity glycerol,HOG)参与病菌对渗透胁迫的响应。蛋白免疫印迹和甘油含量的测定发现,不论是否添加NaCl处理,ΔFgPrb1中FgHog1的磷酸化水平和甘油含量均上升,并伴随着脂滴积累的现象。此外,蛋白免疫印迹试验和蛋白定位试验证明,FgPrb1缺失导致FgAtg8降解延迟并累积在液泡内。综上,FgPrb1负调控HOG信号途径参与调控甘油的合成和脂滴的代谢,进而影响DON毒素的合成,最终影响致病力。
本研究结果表明,FgAp2和FgPrb1通过MAPK(CWI和HOG)信号途径参与调控禾谷镰刀菌的生长发育和致病力过程。目前,FgAp2复合体是否参与FgPrb1的转运过程有待进一步探索。
枯草杆菌蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶家族中的一类重要蛋白酶,参与生物体多项生命活动。然而,在植物病原真菌中尚未对该类蛋白酶进行系统研究。本文鉴定了禾谷镰刀菌中32个枯草杆菌蛋白酶基因,通过同源重组基因敲除技术获得所有基因缺失突变体。生长表型测定发现,32个突变体中仅FgPRB1基因缺失突变体(ΔFgPrb1)表现出生长缺陷。同样,致病性测定发现,仅有ΔFgPrb1在麦穗、胚芽鞘、小麦叶片和玉米须上的致病力均显著下降。毒素测定发现ΔFgPrb1中DON毒素合成减少,毒素合成相关基因的表达量降低。本研究发现FgPrb1通过高渗透性甘油信号途径(High osmolarity glycerol,HOG)参与病菌对渗透胁迫的响应。蛋白免疫印迹和甘油含量的测定发现,不论是否添加NaCl处理,ΔFgPrb1中FgHog1的磷酸化水平和甘油含量均上升,并伴随着脂滴积累的现象。此外,蛋白免疫印迹试验和蛋白定位试验证明,FgPrb1缺失导致FgAtg8降解延迟并累积在液泡内。综上,FgPrb1负调控HOG信号途径参与调控甘油的合成和脂滴的代谢,进而影响DON毒素的合成,最终影响致病力。
本研究结果表明,FgAp2和FgPrb1通过MAPK(CWI和HOG)信号途径参与调控禾谷镰刀菌的生长发育和致病力过程。目前,FgAp2复合体是否参与FgPrb1的转运过程有待进一步探索。