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蝇蛹金小蜂Pachycrepoideus vindemiae是一种蝇类蛹期的单寄生外寄生蜂，其寄主包括果蝇科Drosophilidae、花蝇科Anthomyiidae、丽蝇科Calliphoridae、家蝇科Muscidae、麻蝇科Sarcophagidae、寄蝇科Tachinidae和实蝇科Tephritidae等。该蜂是蝇类的重要生物防治物，目前在斑翅果蝇Drosophila suzukii的防治中已得到很好的应用。该蜂在产卵的同时注射毒液蛋白到寄主体内以调控寄主的细胞免疫和体液免疫反应，其中细胞免疫主要包括血细胞数量、延展和黏附能力的改变，而体液免疫则涉及血淋巴黑化、Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路的调控等。鉴于黑腹果蝇D.melanogaster免疫学有较好的研究基础，且为了更好地解析该蜂与寄主免疫互作的分子机理，本论文特选择其为寄主，对该蜂调控寄主免疫反应的分子机制进行深入探究，并对其毒液蛋白进行了组分鉴定和比较分析。而后选择其中具有重要调控作用的3个毒液蛋白PvCRT、PvKazal和PvUn和若干功能未知的毒液蛋白并做了初步的功能研究，以期为利用寄生性天敌防治植物害虫提供新的研究思路。
1、蝇蛹金小蜂调控寄主果蝇的细胞免疫和体液免疫反应
为了明确蝇蛹金小蜂寄生对寄主果蝇细胞和体液免疫反应的影响，本章就该蜂寄生对寄主血细胞数量、黏附、细胞活力、血淋巴黑化和Toll、Imd及Jak/Stat免疫通路的影响进行了系列研究。结果表明寄生能够显著降低寄主的血细胞数量，具体表现为薄层细胞的贴壁受到抑制和浆血细胞死亡。活体毒液注射和离体毒液与血淋巴共孵育的酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)酶活性分析表明，该蜂毒液能够显著抑制寄主血淋巴的黑化，并具有剂量效应。研究还发现该蜂寄生后1h、6h、12h、24h和72h，寄主的Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路均被激活。通过比较该蜂对三大免疫通路突变体和过表达果蝇品系及野生型果蝇的寄生能力，发现相比于野生型而言，该蜂对不同品系果蝇的寄生率并无显著差异。
2、蝇蛹金小蜂毒液组分鉴定和比较分析
结合毒腺转录组和毒液蛋白质组分析在蝇蛹金小蜂中一共鉴定到64种毒液蛋白，其中包括37个功能已知的组分和27个功能未知性组分。37个功能已知的毒液被归为水解酶类、氧化还原酶类、转移酶类、蛋白酶抑制剂、识别和结合蛋白以及其他类蛋白，其中种类最多的系水解酶类，含22个。对64种毒液蛋白中20个的表达水平进行qPCR验证，结果表明它们在毒腺中的平均表达水平比残体高419倍，可见在毒腺中相对高表达。该蜂和其他5种寄生蜂毒液蛋白的比较分析发现，金小蜂之间存在一类直系同源的毒液基因，即该蜂64个毒液基因中的35个能够很好地匹配到其他金小蜂，其中有27个和25个分别与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis和蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum的毒液基因具有直系同源关系。而该蜂与小环腹瘿蜂科和茧蜂科寄生蜂的比较分析仅各鉴定到5个和2个直系同源的蝇蛹金小蜂毒液基因。此外，还在该蜂毒液中检测到22个特异性的组分。11种寄生蜂毒液蛋白数量与寄生特性之间的相关性分析表明，相较于多寄生蜂，单寄生蜂在与寄主协同进化的过程中演化出更多的毒液组分。为了明确该蜂的进化地位，利用毒液单拷贝基因构建了系统发育树，结果显示该蜂与其他金小蜂，如蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂等聚在一类。
3、蝇蛹金小蜂毒液钙网蛋白PvCRT调控寄主的细胞免疫反应
在蝇蛹金小蜂毒液组分中鉴定到一个钙网蛋白PvCRT，氨基酸序列分析发现PvCRT含一段信号肽和两个保守性“Calreticulin”结构域。多序列比对结果显示PvCRT的氨基酸序列与丽蝇蛹集金小蜂和蝶蛹金小蜂的相似性均高达83.54%。进化分析表明该蜂与丽蝇蛹集金小蜂和蝶蛹金小蜂的亲缘关系较近。通过定量PCR检测，发现PvCRT在毒腺中的转录水平显著低于残体，约为残体的0.27倍，即不在毒腺中特异性表达。免疫组织定位的结果表明PvCRT抗原广泛分布于毒腺中。利用UAS/Gal4异源表达系统将PvCRT基因整合至果蝇的基因组中，并诱导其在寄主免疫组织血细胞和脂肪体中表达，而后进行包囊分析，结果显示表达PvCRT的转基因果蝇能够显著回补tu(1)Sz1突变体的自我包囊表型。此外，绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus免疫刺激后的抗菌肽定量和寄主果蝇存活率实验均表明，PvCRT不影响寄主果蝇的抗菌免疫反应。可见，该蜂的毒液钙网蛋白PvCRT具有抑制寄主血细胞包囊反应的功能。
4、蝇蛹金小蜂毒液蛋白PvKazal和PvUn调控寄主的体液免疫反应
从蝇蛹金小蜂毒液中鉴定到两个具有黑化抑制作用的毒液组分PvKazal和PvUn。定量分析发现PvKazal在毒腺中的转录水平略高于残体，0.01-1mg/ml的PvKazal原核表达产物均能显著抑制寄主果蝇PO的酶活性。构建了PvKazal的转基因果蝇，结果表明表达PvKazal的果蝇幼虫晶细胞数量显著低于非转基因品系，且其蛹期血淋巴的PO酶活性也显著低于对照。同时，还鉴定到一个未知功能的毒液组分PvUn，其在毒腺中的转录水平显著高于残体，约为残体的2600多倍。PvUn同样具有抑制果蝇血淋巴黑化的功能。为了筛选调控果蝇免疫通路的毒液组分，还构建了果蝇Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路的双荧光素酶报告系统，并鉴定到多个能够激活果蝇Toll和Jak/Stat通路及抑制Imd通路的毒液组分。可见，该蜂的毒液蛋白PvKazal和PvUn都具有抑制寄主血淋巴黑化反应的功能，且其中的大部分组分对寄主的Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路均具有调控作用。
综上所述，本研究阐明了该蜂粗毒液可以降低寄主的血细胞数量、抑制薄层细胞黏附、诱导浆血细胞死亡、阻断寄主血淋巴的黑化反应，但却可以激活寄主的Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路。结合毒腺转录组和毒液蛋白质组分析在该蜂毒液中一共鉴定到64种蛋白，其中包括37个功能已知的组分和27个功能未知性组分，比较分析发现该蜂与其他金小蜂存在一类直系同源的毒液基因。毒液蛋白的功能研究表明，PvCRT能够抑制寄主血细胞的包囊反应，而PvKazal和PvUn都具有抑制寄主血淋巴黑化反应的功能。此外，还鉴定到多个能够激活果蝇Toll和Jak/Stat通路及抑制Imd通路的毒液组分。
1、蝇蛹金小蜂调控寄主果蝇的细胞免疫和体液免疫反应
为了明确蝇蛹金小蜂寄生对寄主果蝇细胞和体液免疫反应的影响，本章就该蜂寄生对寄主血细胞数量、黏附、细胞活力、血淋巴黑化和Toll、Imd及Jak/Stat免疫通路的影响进行了系列研究。结果表明寄生能够显著降低寄主的血细胞数量，具体表现为薄层细胞的贴壁受到抑制和浆血细胞死亡。活体毒液注射和离体毒液与血淋巴共孵育的酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)酶活性分析表明，该蜂毒液能够显著抑制寄主血淋巴的黑化，并具有剂量效应。研究还发现该蜂寄生后1h、6h、12h、24h和72h，寄主的Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路均被激活。通过比较该蜂对三大免疫通路突变体和过表达果蝇品系及野生型果蝇的寄生能力，发现相比于野生型而言，该蜂对不同品系果蝇的寄生率并无显著差异。
2、蝇蛹金小蜂毒液组分鉴定和比较分析
结合毒腺转录组和毒液蛋白质组分析在蝇蛹金小蜂中一共鉴定到64种毒液蛋白，其中包括37个功能已知的组分和27个功能未知性组分。37个功能已知的毒液被归为水解酶类、氧化还原酶类、转移酶类、蛋白酶抑制剂、识别和结合蛋白以及其他类蛋白，其中种类最多的系水解酶类，含22个。对64种毒液蛋白中20个的表达水平进行qPCR验证，结果表明它们在毒腺中的平均表达水平比残体高419倍，可见在毒腺中相对高表达。该蜂和其他5种寄生蜂毒液蛋白的比较分析发现，金小蜂之间存在一类直系同源的毒液基因，即该蜂64个毒液基因中的35个能够很好地匹配到其他金小蜂，其中有27个和25个分别与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis和蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum的毒液基因具有直系同源关系。而该蜂与小环腹瘿蜂科和茧蜂科寄生蜂的比较分析仅各鉴定到5个和2个直系同源的蝇蛹金小蜂毒液基因。此外，还在该蜂毒液中检测到22个特异性的组分。11种寄生蜂毒液蛋白数量与寄生特性之间的相关性分析表明，相较于多寄生蜂，单寄生蜂在与寄主协同进化的过程中演化出更多的毒液组分。为了明确该蜂的进化地位，利用毒液单拷贝基因构建了系统发育树，结果显示该蜂与其他金小蜂，如蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂等聚在一类。
3、蝇蛹金小蜂毒液钙网蛋白PvCRT调控寄主的细胞免疫反应
在蝇蛹金小蜂毒液组分中鉴定到一个钙网蛋白PvCRT，氨基酸序列分析发现PvCRT含一段信号肽和两个保守性“Calreticulin”结构域。多序列比对结果显示PvCRT的氨基酸序列与丽蝇蛹集金小蜂和蝶蛹金小蜂的相似性均高达83.54%。进化分析表明该蜂与丽蝇蛹集金小蜂和蝶蛹金小蜂的亲缘关系较近。通过定量PCR检测，发现PvCRT在毒腺中的转录水平显著低于残体，约为残体的0.27倍，即不在毒腺中特异性表达。免疫组织定位的结果表明PvCRT抗原广泛分布于毒腺中。利用UAS/Gal4异源表达系统将PvCRT基因整合至果蝇的基因组中，并诱导其在寄主免疫组织血细胞和脂肪体中表达，而后进行包囊分析，结果显示表达PvCRT的转基因果蝇能够显著回补tu(1)Sz1突变体的自我包囊表型。此外，绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus免疫刺激后的抗菌肽定量和寄主果蝇存活率实验均表明，PvCRT不影响寄主果蝇的抗菌免疫反应。可见，该蜂的毒液钙网蛋白PvCRT具有抑制寄主血细胞包囊反应的功能。
4、蝇蛹金小蜂毒液蛋白PvKazal和PvUn调控寄主的体液免疫反应
从蝇蛹金小蜂毒液中鉴定到两个具有黑化抑制作用的毒液组分PvKazal和PvUn。定量分析发现PvKazal在毒腺中的转录水平略高于残体，0.01-1mg/ml的PvKazal原核表达产物均能显著抑制寄主果蝇PO的酶活性。构建了PvKazal的转基因果蝇，结果表明表达PvKazal的果蝇幼虫晶细胞数量显著低于非转基因品系，且其蛹期血淋巴的PO酶活性也显著低于对照。同时，还鉴定到一个未知功能的毒液组分PvUn，其在毒腺中的转录水平显著高于残体，约为残体的2600多倍。PvUn同样具有抑制果蝇血淋巴黑化的功能。为了筛选调控果蝇免疫通路的毒液组分，还构建了果蝇Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路的双荧光素酶报告系统，并鉴定到多个能够激活果蝇Toll和Jak/Stat通路及抑制Imd通路的毒液组分。可见，该蜂的毒液蛋白PvKazal和PvUn都具有抑制寄主血淋巴黑化反应的功能，且其中的大部分组分对寄主的Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路均具有调控作用。
综上所述，本研究阐明了该蜂粗毒液可以降低寄主的血细胞数量、抑制薄层细胞黏附、诱导浆血细胞死亡、阻断寄主血淋巴的黑化反应，但却可以激活寄主的Toll、Imd和Jak/Stat免疫通路。结合毒腺转录组和毒液蛋白质组分析在该蜂毒液中一共鉴定到64种蛋白，其中包括37个功能已知的组分和27个功能未知性组分，比较分析发现该蜂与其他金小蜂存在一类直系同源的毒液基因。毒液蛋白的功能研究表明，PvCRT能够抑制寄主血细胞的包囊反应，而PvKazal和PvUn都具有抑制寄主血淋巴黑化反应的功能。此外，还鉴定到多个能够激活果蝇Toll和Jak/Stat通路及抑制Imd通路的毒液组分。