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寄生蜂隶属膜翅目(Hymenoptera)，是最为多样的带毒生物群，据估算全球种类在15万到60万之间。与通常的捕食和防御动物的毒液不同，雌性寄生蜂利用毒液控制其他节肢动物的新陈代谢、发育和行为，以利于自身的后代繁衍(Mrinalini and Werren，2017)。寄生蜂是一类重要的害虫天敌，极具生防价值。依据寄生策略不同，将寄生蜂分为内寄生蜂和外寄生蜂两类。在寄主的血腔产卵的为内寄生蜂，在寄主表面产卵的为外寄生蜂(Moreau and Asgari，2015)。蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)，膜翅目金小蜂科(Hymenoptera:Pteromalidae)，是菜粉蝶Pieris rapae(十字花科蔬菜的重要害虫)的蛹期优势寄生蜂。该蜂在寄生过程中将毒液和卵注射到寄主血腔中，能够通过调控寄主的免疫以及发育代谢，来保护其子代的发育。在本论文中，主要聚焦于蝶蛹金小蜂中毒液α-淀粉酶与非毒液α-淀粉酶功能比较研究，以及未知毒液蛋白的分子特性与功能研究。
1、蝶蛹金小蜂毒液与非毒液α-淀粉酶的分子特性与功能的比较研究
基于所在研究团队解析得到的蝶蛹金小蜂毒液蛋白组分以及该蜂的基因组与转录组数据，在蝶蛹金小蜂的毒液蛋白组分中找到一个类淀粉酶基因，经过同源比对分析后找到了另外两个类淀粉酶。随后，对这3个基因序列进行克隆与序列分析、系统发育分析、定量检测，以及真核表达与测定淀粉酶活性后，确认了3个序列均为α-淀粉酶，并分别命名为PpAmy1、PpAmy2和PpAmy3。3个基因存在组织特异性，PpAmy1在肠道中特异性高表达，PpAmy2在全身表达且在肌肉组织中表达较高，PpAmy3在毒液中特异性高表达。最后，使用RNAi以及代谢组学技术对3个基因的功能进行探索。最终结果表明PpAmy1在寄生蜂肠道中发挥作用；PpAmy2在寄生蜂肌肉的代谢中发挥作用；PpAmy3能够影响寄主血淋巴代谢，并且可能有助于寄生蜂子代的发育。
2、蝶蛹金小蜂毒液未知蛋白分子特性与表达模式分析
基于本研究团队现有蝶蛹金小蜂转录组、基因组和毒液蛋白组有关数据，得知在蝶蛹金小蜂毒液中有17种毒液未知蛋白。经过在毒液中高表达，有信号肽并能有效克隆的指标进行筛选后，对其中8个基因进行了克隆和表达，结果表明这8个基因在毒腺中特异性高表达，其中6个基因能获得纯化蛋白。为后续功能分析奠定了基础。
3、蝶蛹金小蜂毒液未知蛋白PpVPG功能分析
将毒液中特异性高表达的一种毒液未知蛋白命名为PpVPG(Pteromalus puparum venom protein G)。明确该基因的序列为447bp，CDS长303bp，蛋白序列由101氨基酸残基组成，预测分子量10.8kDa，前17个氨基酸为信号肽，去掉信号肽的后蛋白分子量约8.4kDa，由于没有可参照的模型，该蛋白不能预测到它的三维结构。通过对其进行原核表达，最终在上清中获得该蛋白，并合成了抗体。使用RNAi使其沉默后的寄生蜂寄生寄主，寄生率与对照组相比显著降低。在体外进行酚氧化酶原PPO活性检测的结果表明，该蛋白可以通过抑制PPO的激活来抑制菜粉蝶血淋巴黑化，但是并不直接影响其血淋巴的酚氧化酶PO活性。最后，将PpVPG蛋白注射到菜粉蝶蛹中进行RNA-seq，结果表明该蛋白可能对寄主的免疫、表皮、神经元、解毒和氨基酸代谢等基因的表达产生影响。
1、蝶蛹金小蜂毒液与非毒液α-淀粉酶的分子特性与功能的比较研究
基于所在研究团队解析得到的蝶蛹金小蜂毒液蛋白组分以及该蜂的基因组与转录组数据，在蝶蛹金小蜂的毒液蛋白组分中找到一个类淀粉酶基因，经过同源比对分析后找到了另外两个类淀粉酶。随后，对这3个基因序列进行克隆与序列分析、系统发育分析、定量检测，以及真核表达与测定淀粉酶活性后，确认了3个序列均为α-淀粉酶，并分别命名为PpAmy1、PpAmy2和PpAmy3。3个基因存在组织特异性，PpAmy1在肠道中特异性高表达，PpAmy2在全身表达且在肌肉组织中表达较高，PpAmy3在毒液中特异性高表达。最后，使用RNAi以及代谢组学技术对3个基因的功能进行探索。最终结果表明PpAmy1在寄生蜂肠道中发挥作用；PpAmy2在寄生蜂肌肉的代谢中发挥作用；PpAmy3能够影响寄主血淋巴代谢，并且可能有助于寄生蜂子代的发育。
2、蝶蛹金小蜂毒液未知蛋白分子特性与表达模式分析
基于本研究团队现有蝶蛹金小蜂转录组、基因组和毒液蛋白组有关数据，得知在蝶蛹金小蜂毒液中有17种毒液未知蛋白。经过在毒液中高表达，有信号肽并能有效克隆的指标进行筛选后，对其中8个基因进行了克隆和表达，结果表明这8个基因在毒腺中特异性高表达，其中6个基因能获得纯化蛋白。为后续功能分析奠定了基础。
3、蝶蛹金小蜂毒液未知蛋白PpVPG功能分析
将毒液中特异性高表达的一种毒液未知蛋白命名为PpVPG(Pteromalus puparum venom protein G)。明确该基因的序列为447bp，CDS长303bp，蛋白序列由101氨基酸残基组成，预测分子量10.8kDa，前17个氨基酸为信号肽，去掉信号肽的后蛋白分子量约8.4kDa，由于没有可参照的模型，该蛋白不能预测到它的三维结构。通过对其进行原核表达，最终在上清中获得该蛋白，并合成了抗体。使用RNAi使其沉默后的寄生蜂寄生寄主，寄生率与对照组相比显著降低。在体外进行酚氧化酶原PPO活性检测的结果表明，该蛋白可以通过抑制PPO的激活来抑制菜粉蝶血淋巴黑化，但是并不直接影响其血淋巴的酚氧化酶PO活性。最后，将PpVPG蛋白注射到菜粉蝶蛹中进行RNA-seq，结果表明该蛋白可能对寄主的免疫、表皮、神经元、解毒和氨基酸代谢等基因的表达产生影响。