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背景及目的
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）是严重威胁人类生命的急性炎症性疾病，主要是由创伤、感染、休克、中毒等致病因素导致的急性呼吸功能衰竭。急性肺损伤的发病机制目前尚未完全阐明，近年来炎症学说备受关注，该学说认为细菌内毒素是引起急性肺损伤的关键因素。内毒素的活性成分脂多糖（LPS）为革兰氏阴性菌细胞壁主要成分，LPS致ALI同时可引起多种炎性介质的释放。髓样分化蛋白2（MD2）是TLR4识别LPS中的重要衔接蛋白，在LPS诱导炎症反应的过程中起重要作用。我们前期设计合成了一系列查尔酮类似物，并且获得了多个具有抗炎活性的化合物，如7w和7x。基于7w和7x的化学结构，我们发现它们与已经报道的多个MD2小分子抑制剂具有相同的骨架结构，因此我们认为化合物7w和7x可能是通过靶向MD2发挥抗炎效果。因此，本实验将通过体内外实验阐明7w和7x对LPS诱导的急性炎症反应的药理活性和分子机制。
方法
1.在分子层面上：利用表面等离子共振实验（SPR）技术和荧光检测等多种分子生物学实验方法初步评价化合物7w和7x是否能够与MD2蛋白直接结合。同时，通过免疫共沉淀和酶联免疫吸附实验（ELISA）的方法检测7w和7x是否可以抑制LPS诱导的TLR4和MD2的复合。
2.在细胞层面上：利用LPS刺激小鼠原代巨噬细胞（MPMs）构建细胞模型，给予7w和7x预处理细胞。采用ELISA实验检测培养基中炎症因子TNF-α和IL-6的含量，RT-qPCR实验来检测炎症因子的基因表达，WesternBlot和免疫荧光等实验来检测MAPKs和NF-κB信号通路的激活。
3.在动物层面上：将32只C57BL/6小鼠随机分为4组：CON组（空白对照组）、LPS组（模型组）、LPS+7w组（小鼠连续灌胃给予10mg/kg/day7w，最后一次灌胃后15min气管滴注LPS）和LPS+7x组（小鼠连续灌胃给予10mg/kg/day7x，最后一次灌胃后15min气管滴注LPS）组。连续灌胃给药7天后，气管滴注LPS，造模6h后收集各组小鼠肺泡灌洗液（BALF）和血清来检测炎症因子表达以及BALF总细胞数；肺上叶检测湿干重；肺中叶进行H&E染色以及炎症指标的免疫组化染色；利用RT-qPCR和WesternBlot实验检测各组小鼠肺组织中炎症损伤指标。
结果
1.在分子水平上，利用SPR技术及bis-ANS荧光检测实验发现化合物7w和7x可剂量依赖性地与MD2蛋白直接结合。免疫共沉淀和ELISA实验结果证明化合物7w和7x均能拮抗LPS与MD2蛋白的结合以及TLR4与MD2复合物的形成。这些实验表明，7w和7x是MD2蛋白的小分子抑制剂，并且能够通过靶向MD2抑制LPS的活性。
2.体外实验结果表明化合物7w和7x靶向MD2降低LPS诱导的原代巨噬细胞释放炎症因子TNF-α和IL-6，抑制炎症基因TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1的表达。Westernblot和免疫荧光实验结果也表明7w和7x可以有效地抑制LPS诱导的MAPKs信号通路的磷酸化以及IκB的降解，同时降低LPS引起的胞浆P65转移入核。这些实验表明7w和7x在体外能够抑制LPS诱导的炎症因子表达和炎症信号通路的激活。
3.体内实验结果表明化合物7w和7x可以缓解LPS造成的急性肺损伤小鼠肺组织水肿和病理变化，抑制炎症细胞因子的释放和炎性细胞的浸润，下调急性肺损伤小鼠肺组织中TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1的表达，免疫共沉淀实验结果也证明7w和7x能够抑制LPS诱导的肺组织中TLR4和MD2复合物的形成。这些实验表明，7w和7x可以通过靶向MD2缓解LPS诱导的急性肺损伤。
结论
本实验发现化合物7w和7x是MD2蛋白的小分子抑制剂，在体外通过抑制MAPKs信号通路的磷酸化和NF-κB信号通路的激活缓解LPS诱导的原代巨噬细胞炎症反应，在体内通过抑制LPS诱导的MD2和TLR4的结合明显的降低炎症因子表达和炎性细胞浸润从而缓解急性肺损伤。因此，7w和7x是MD2蛋白的小分子抑制剂，具有良好的抗炎活性，可以作为用于治疗急性肺损伤的潜在药物，同时为MD2小分子抑制剂的发现提供先导化合物。
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）是严重威胁人类生命的急性炎症性疾病，主要是由创伤、感染、休克、中毒等致病因素导致的急性呼吸功能衰竭。急性肺损伤的发病机制目前尚未完全阐明，近年来炎症学说备受关注，该学说认为细菌内毒素是引起急性肺损伤的关键因素。内毒素的活性成分脂多糖（LPS）为革兰氏阴性菌细胞壁主要成分，LPS致ALI同时可引起多种炎性介质的释放。髓样分化蛋白2（MD2）是TLR4识别LPS中的重要衔接蛋白，在LPS诱导炎症反应的过程中起重要作用。我们前期设计合成了一系列查尔酮类似物，并且获得了多个具有抗炎活性的化合物，如7w和7x。基于7w和7x的化学结构，我们发现它们与已经报道的多个MD2小分子抑制剂具有相同的骨架结构，因此我们认为化合物7w和7x可能是通过靶向MD2发挥抗炎效果。因此，本实验将通过体内外实验阐明7w和7x对LPS诱导的急性炎症反应的药理活性和分子机制。
方法
1.在分子层面上：利用表面等离子共振实验（SPR）技术和荧光检测等多种分子生物学实验方法初步评价化合物7w和7x是否能够与MD2蛋白直接结合。同时，通过免疫共沉淀和酶联免疫吸附实验（ELISA）的方法检测7w和7x是否可以抑制LPS诱导的TLR4和MD2的复合。
2.在细胞层面上：利用LPS刺激小鼠原代巨噬细胞（MPMs）构建细胞模型，给予7w和7x预处理细胞。采用ELISA实验检测培养基中炎症因子TNF-α和IL-6的含量，RT-qPCR实验来检测炎症因子的基因表达，WesternBlot和免疫荧光等实验来检测MAPKs和NF-κB信号通路的激活。
3.在动物层面上：将32只C57BL/6小鼠随机分为4组：CON组（空白对照组）、LPS组（模型组）、LPS+7w组（小鼠连续灌胃给予10mg/kg/day7w，最后一次灌胃后15min气管滴注LPS）和LPS+7x组（小鼠连续灌胃给予10mg/kg/day7x，最后一次灌胃后15min气管滴注LPS）组。连续灌胃给药7天后，气管滴注LPS，造模6h后收集各组小鼠肺泡灌洗液（BALF）和血清来检测炎症因子表达以及BALF总细胞数；肺上叶检测湿干重；肺中叶进行H&E染色以及炎症指标的免疫组化染色；利用RT-qPCR和WesternBlot实验检测各组小鼠肺组织中炎症损伤指标。
结果
1.在分子水平上，利用SPR技术及bis-ANS荧光检测实验发现化合物7w和7x可剂量依赖性地与MD2蛋白直接结合。免疫共沉淀和ELISA实验结果证明化合物7w和7x均能拮抗LPS与MD2蛋白的结合以及TLR4与MD2复合物的形成。这些实验表明，7w和7x是MD2蛋白的小分子抑制剂，并且能够通过靶向MD2抑制LPS的活性。
2.体外实验结果表明化合物7w和7x靶向MD2降低LPS诱导的原代巨噬细胞释放炎症因子TNF-α和IL-6，抑制炎症基因TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1的表达。Westernblot和免疫荧光实验结果也表明7w和7x可以有效地抑制LPS诱导的MAPKs信号通路的磷酸化以及IκB的降解，同时降低LPS引起的胞浆P65转移入核。这些实验表明7w和7x在体外能够抑制LPS诱导的炎症因子表达和炎症信号通路的激活。
3.体内实验结果表明化合物7w和7x可以缓解LPS造成的急性肺损伤小鼠肺组织水肿和病理变化，抑制炎症细胞因子的释放和炎性细胞的浸润，下调急性肺损伤小鼠肺组织中TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1的表达，免疫共沉淀实验结果也证明7w和7x能够抑制LPS诱导的肺组织中TLR4和MD2复合物的形成。这些实验表明，7w和7x可以通过靶向MD2缓解LPS诱导的急性肺损伤。
结论
本实验发现化合物7w和7x是MD2蛋白的小分子抑制剂，在体外通过抑制MAPKs信号通路的磷酸化和NF-κB信号通路的激活缓解LPS诱导的原代巨噬细胞炎症反应，在体内通过抑制LPS诱导的MD2和TLR4的结合明显的降低炎症因子表达和炎性细胞浸润从而缓解急性肺损伤。因此，7w和7x是MD2蛋白的小分子抑制剂，具有良好的抗炎活性，可以作为用于治疗急性肺损伤的潜在药物，同时为MD2小分子抑制剂的发现提供先导化合物。