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背景与目的：成纤维细胞生长因子4（FGF4）作为成纤维细胞生长因子家族中的一个成员，具有多种功能，包括促进多种细胞的增殖，迁移，存活和分化。此外，已有大量研究证实FGF4具有促进血管生成的作用。但是现有的FGF4纯化工艺较为繁琐，本实验利用大肠杆菌以包涵体的形式高效表达重组人FGF4（rhFGF4）蛋白，并利用肝素柱柱上复性与纯化、一步得到高纯度并具有生物学活性的蛋白。建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）高糖损伤模型，观察rhFGF4对高糖损伤的HUVEC细胞的保护作用，并从细胞分子层面阐述了其保护机制。
方法：1：从GeneBank获取人fgf4目的基因序列，并由GENEWIZ公司根据大肠杆菌偏好性优化合成。将目的基因与pET-3d表达载体连接，构建pET3d-rhFGF4重组质粒。重组质粒经测序验证后转化到BL21(DE3)PlysS表达菌中，20、35℃分别诱导后离心收菌，超声破碎后经SDS-PAGE验证，rhFGF4蛋白主要以包涵体形式表达。
2：用两种不同的洗涤缓冲液清洗包涵体，将其充分溶解于8mol/L脲变性溶液中，在变性条件下与肝素亲和层析柱充分结合后柱上进行梯度复性，并直接利用该肝素柱纯化复性后的rhFGF4蛋白。
3：得到高纯度rhFGF4蛋白后，利用MTT法分别检测该重组蛋白对NIH3T3细胞以及HUVEC细胞的促增殖生物学活性。
4：确定合适的高糖损伤浓度和时间，构建HUVEC细胞高糖损伤模型，检测不同浓度rhFGF4蛋白对该模型细胞的保护作用。
5：利用WesternBlot技术检测凋亡相关蛋白的表达变化，并初步探索rhFGF4蛋白对高糖损伤的HUVEC细胞的保护机制。
结果：1：优化合成fgf4基因，并与pET-3d表达载体连接，构建得到pET3d-rhFGF4重组质粒。将该重组质粒转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)PlysS感受态中，在一定条件下，诱导得到以包涵体形式表达的rhFGF4重组蛋白，外源蛋白表达量占菌体总蛋白30%左右。
2：得到的包涵体蛋白经过洗涤后，用8mol/L脲变性，并利用肝素亲和层析柱进行柱上复性与纯化，得到纯度高于95%的rhFGF4蛋白。
3：利用MTT法分别检测rhFGF4蛋白对NIH3T3细胞以及HUVEC细胞的促增殖生物学活性，结果表明rhFGF4蛋白能显著促进NIH3T3细胞以及HUVEC细胞的增殖。
4：通过MTT法，MDA以及ROS含量检测证明了rhFGF4蛋白对高糖损伤的HUVEC细胞有保护作用。与高糖损伤组相比，rhFGF4蛋白实验组细胞凋亡率明显下降，MDA和ROS含量也显著下降。
5：利用WesternBlot技术检测分析相关信号蛋白的表达，结果表明与高糖损伤组相比，rhFGF4蛋白实验组Bax/Bcl-2、p-JNK/JNK、p-p38/p38以及p-p65/p65的比率显著降低。
结论：本研究成功的利用大肠杆菌以包涵体的形式高效表达rhFGF4蛋白，并利用肝素柱柱上复性与纯化、一步得到高纯度并具有生物学活性的蛋白。体外细胞实验表明，rhFGF4能够显著刺激NIH3T3细胞和HUVEC细胞增殖，能够通过阻止JNK，p38以及p65的磷酸化来修复高糖诱导损伤的HUVEC细胞及抑制其凋亡，并且能降低其MDA以及ROS含量。
方法：1：从GeneBank获取人fgf4目的基因序列，并由GENEWIZ公司根据大肠杆菌偏好性优化合成。将目的基因与pET-3d表达载体连接，构建pET3d-rhFGF4重组质粒。重组质粒经测序验证后转化到BL21(DE3)PlysS表达菌中，20、35℃分别诱导后离心收菌，超声破碎后经SDS-PAGE验证，rhFGF4蛋白主要以包涵体形式表达。
2：用两种不同的洗涤缓冲液清洗包涵体，将其充分溶解于8mol/L脲变性溶液中，在变性条件下与肝素亲和层析柱充分结合后柱上进行梯度复性，并直接利用该肝素柱纯化复性后的rhFGF4蛋白。
3：得到高纯度rhFGF4蛋白后，利用MTT法分别检测该重组蛋白对NIH3T3细胞以及HUVEC细胞的促增殖生物学活性。
4：确定合适的高糖损伤浓度和时间，构建HUVEC细胞高糖损伤模型，检测不同浓度rhFGF4蛋白对该模型细胞的保护作用。
5：利用WesternBlot技术检测凋亡相关蛋白的表达变化，并初步探索rhFGF4蛋白对高糖损伤的HUVEC细胞的保护机制。
结果：1：优化合成fgf4基因，并与pET-3d表达载体连接，构建得到pET3d-rhFGF4重组质粒。将该重组质粒转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)PlysS感受态中，在一定条件下，诱导得到以包涵体形式表达的rhFGF4重组蛋白，外源蛋白表达量占菌体总蛋白30%左右。
2：得到的包涵体蛋白经过洗涤后，用8mol/L脲变性，并利用肝素亲和层析柱进行柱上复性与纯化，得到纯度高于95%的rhFGF4蛋白。
3：利用MTT法分别检测rhFGF4蛋白对NIH3T3细胞以及HUVEC细胞的促增殖生物学活性，结果表明rhFGF4蛋白能显著促进NIH3T3细胞以及HUVEC细胞的增殖。
4：通过MTT法，MDA以及ROS含量检测证明了rhFGF4蛋白对高糖损伤的HUVEC细胞有保护作用。与高糖损伤组相比，rhFGF4蛋白实验组细胞凋亡率明显下降，MDA和ROS含量也显著下降。
5：利用WesternBlot技术检测分析相关信号蛋白的表达，结果表明与高糖损伤组相比，rhFGF4蛋白实验组Bax/Bcl-2、p-JNK/JNK、p-p38/p38以及p-p65/p65的比率显著降低。
结论：本研究成功的利用大肠杆菌以包涵体的形式高效表达rhFGF4蛋白，并利用肝素柱柱上复性与纯化、一步得到高纯度并具有生物学活性的蛋白。体外细胞实验表明，rhFGF4能够显著刺激NIH3T3细胞和HUVEC细胞增殖，能够通过阻止JNK，p38以及p65的磷酸化来修复高糖诱导损伤的HUVEC细胞及抑制其凋亡，并且能降低其MDA以及ROS含量。