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研究背景：紫外吸收剂UV-9具有较好的紫外吸收性能，常用于防晒霜等化妆品中。已经有实验表明，紫外吸收剂UV-9具有生殖毒性以及内分泌干扰的作用，且在尿液、羊水、胎盘以及乳汁中均可检测出。由于哺乳动物乳腺是一种激素依赖性的器官，外源性雌激素的刺激会加大乳腺癌的发生风险，而乳腺癌的发生可能是乳腺干细胞转变为乳腺癌干细胞所导致的，且乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生、发展、转移和侵袭方面发挥重要作用。因此本实验通过探究紫外吸收剂UV-9对乳腺干细胞和乳腺癌干细胞的影响以及作用机制来为乳腺癌的发生机制研究和预防提供参考。
研究方法：本实验分为两部分进行。第一部分实验选用FVB-GFP小鼠作为研究对象，将刚进入青春期的3周龄小鼠随机分为3组，分别为对照组、较低剂量处理组（0.2mg/kg/day）和理论上安全剂量处理组（200mg/kg/day），进行连续4周的灌胃处理，灌胃结束后选取其中的一部分小鼠进行立即处理，观察青春期暴露对小鼠乳腺干细胞的即时效应，同时留取一部分小鼠于正常环境继续无处理饲养滞后2个月，收集乳腺研究青春期暴露对小鼠乳腺干细胞的滞后效应。在本部分实验中，将小鼠颈椎脱臼处死后收集小鼠的左侧胸腺部位以及腹股沟部位的乳腺组织进行导管形态观察以及病理学方面的分析，比较不同的剂量组对小鼠乳腺导管发育以及形态方面的影响，同时收集右侧胸腺部位以及腹股沟部位的乳腺利用实验室优化好的乳腺组织消化条件，将乳腺组织消化制备成单细胞悬液，利用流式分选的方法将乳腺上皮细胞根据乳腺干细胞表面标志物(CD24,CD49f)的不同分选为不同的细胞亚群：基底细胞的亚群(MRU,CD49fhiCD24+)和管腔细胞的亚群(CFC,CD49flowCD24hi)。将分选的细胞种到低吸附的96孔板中进行sphere的悬浮培养，以此来检测乳腺干细胞的增殖能力以及自我更新能力，然后将长到第六天的微球种到Matrigel基质胶中，培养形成3D，在第九天统计3D的直径以及3D的形态来分析乳腺干细胞的增殖能力和分化能力。接下来研究青春期紫外吸收剂UV-9的暴露对小鼠乳腺滞后效应的影响，即在小鼠青春期暴露结束后，将小鼠在正常的饲养环境中饲养4个月大时收集小鼠的乳腺进行滞后效应的研究，方法与即时效应的方法相同。最后根据即时效应以及滞后效应的实验结果通过免疫组化的方法检测相关蛋白的表达情况探究紫外吸收剂UV-9对小鼠乳腺的初步作用机制。第二部分选用不同ER敏感型的细胞系ER+(MCF-7)，ER-(MDA-MB-231,SKBR3)用1μg/L的剂量进行紫外吸收剂UV-9的暴露。用CCK8试剂盒检测经紫外吸收剂UV-9暴露之后对不同ER敏感型细胞活性的影响，利用划痕实验来检测紫外吸收剂UV-9暴露对乳腺癌细胞迁移能力的影响。我们根据乳腺癌干细胞表面的标志物通过流式分选的方法，分选出乳腺癌干细胞，在癌干细胞的基础上利用低吸附悬浮培养的方法来检测经紫外吸收剂UV-9处理之后对乳腺癌干细胞增殖能力的影响，最后利用免疫细胞化学的实验方法进行机制方面的探索。
研究结果：第一部分紫外吸收剂UV-9对小鼠青春期乳腺干细胞影响的即时效应结果显示，0.2mg/kg，200mg/kg的剂量组均不影响乳腺导管生长发育的速度，200mg/kg的剂量组导致小鼠乳腺末端芽的数量增加，0.2mg/kg的剂量组增加了乳腺导管增生的比例。流式分选结果表明，两个剂量组均显著性降低基底细胞占总上皮细胞的比例。后续的干细胞体外培养的实验结果显示，0.2mg/kg的处理组增强了乳腺管腔干细胞的微球形成能力，以及3D直径的大小，200mg/kg的剂量组降低了乳腺微球的形成能力以及3D直径的大小。免疫组化结果表明，只有0.2mg/kg的剂量组提升了Ki67的表达水平，同时降低了ERα的表达水。滞后效应的结果表明，0.2mg/kg，200mg/kg的处理组与对照组相比均没有显著性的影响，说明不会对乳腺的发育造成永久性损伤的结果。第二部分紫外吸收剂UV-9对不同ER敏感型乳腺癌干细胞的结果显示，紫外吸收剂UV-9可以增强ER+的细胞系的活性，降低ER-的细胞系的活性。在划痕实验的结果中，紫外吸收剂UV-9促进ER+的细胞系的迁移能力，对ER-的细胞系的迁移能力没有显著性影响。免疫细胞化学的实验结果显示经紫外吸收剂UV-9处理之后降低ER+的细胞的Caspase3的蛋白水平，增强ER-的细胞的Caspase3蛋白表达水平，同时均不影响PCNA蛋白的表达水平。在免疫组化的实验结果中，经E2和紫外吸收剂UV-9处理之后都表现出ERα蛋白水平下降的现象，说明紫外吸收剂UV-9具有雌激素的活性。在Aqp1的免疫细胞化学实验中，紫外吸收剂UV-9在处理乳腺癌干细胞形成微球的过程中上调了ER+的细胞Apq1的表达。在Aqp1作用途径的结果显示可能不通过p38-MAPK的信号通路进行作用。
研究结论：紫外吸收剂UV-9对小鼠青春期乳腺干细胞即时效应的结果显示，200mg/kg的剂量组增加了小鼠乳腺末端芽的数量，0.2mg/kg的剂量组引起乳腺导管的异常增生，两个剂量组同时降低基底细胞占总上皮细胞的比例说明对基底干细胞有损伤的作用；0.2mg/kg的剂量组提升乳腺管腔干细胞的增殖性能，200mg/kg的剂量组使乳腺管腔干细胞的增殖性能降低。免疫组化的结果显示紫外吸收剂UV-9可能通过改变雌激素受体的表达水平来发挥作用。在滞后效应的结果中，处理组和对照组相比均没有显著性的变化。紫外吸收剂UV-9对不同ER敏感型乳腺癌干细胞的影响的结果显示，紫外吸收剂UV-9具有类雌激素的作用可通过下调Caspase3的表达抑制凋亡的产生促进乳腺癌的发生发展，与此同时可促进水通道蛋白Aqp1的表达来参与癌症的发生和发展。本实验的研究结果可为紫外吸收剂UV-9的使用做一个安全的评估，以及为后续的研究提供依据。
研究方法：本实验分为两部分进行。第一部分实验选用FVB-GFP小鼠作为研究对象，将刚进入青春期的3周龄小鼠随机分为3组，分别为对照组、较低剂量处理组（0.2mg/kg/day）和理论上安全剂量处理组（200mg/kg/day），进行连续4周的灌胃处理，灌胃结束后选取其中的一部分小鼠进行立即处理，观察青春期暴露对小鼠乳腺干细胞的即时效应，同时留取一部分小鼠于正常环境继续无处理饲养滞后2个月，收集乳腺研究青春期暴露对小鼠乳腺干细胞的滞后效应。在本部分实验中，将小鼠颈椎脱臼处死后收集小鼠的左侧胸腺部位以及腹股沟部位的乳腺组织进行导管形态观察以及病理学方面的分析，比较不同的剂量组对小鼠乳腺导管发育以及形态方面的影响，同时收集右侧胸腺部位以及腹股沟部位的乳腺利用实验室优化好的乳腺组织消化条件，将乳腺组织消化制备成单细胞悬液，利用流式分选的方法将乳腺上皮细胞根据乳腺干细胞表面标志物(CD24,CD49f)的不同分选为不同的细胞亚群：基底细胞的亚群(MRU,CD49fhiCD24+)和管腔细胞的亚群(CFC,CD49flowCD24hi)。将分选的细胞种到低吸附的96孔板中进行sphere的悬浮培养，以此来检测乳腺干细胞的增殖能力以及自我更新能力，然后将长到第六天的微球种到Matrigel基质胶中，培养形成3D，在第九天统计3D的直径以及3D的形态来分析乳腺干细胞的增殖能力和分化能力。接下来研究青春期紫外吸收剂UV-9的暴露对小鼠乳腺滞后效应的影响，即在小鼠青春期暴露结束后，将小鼠在正常的饲养环境中饲养4个月大时收集小鼠的乳腺进行滞后效应的研究，方法与即时效应的方法相同。最后根据即时效应以及滞后效应的实验结果通过免疫组化的方法检测相关蛋白的表达情况探究紫外吸收剂UV-9对小鼠乳腺的初步作用机制。第二部分选用不同ER敏感型的细胞系ER+(MCF-7)，ER-(MDA-MB-231,SKBR3)用1μg/L的剂量进行紫外吸收剂UV-9的暴露。用CCK8试剂盒检测经紫外吸收剂UV-9暴露之后对不同ER敏感型细胞活性的影响，利用划痕实验来检测紫外吸收剂UV-9暴露对乳腺癌细胞迁移能力的影响。我们根据乳腺癌干细胞表面的标志物通过流式分选的方法，分选出乳腺癌干细胞，在癌干细胞的基础上利用低吸附悬浮培养的方法来检测经紫外吸收剂UV-9处理之后对乳腺癌干细胞增殖能力的影响，最后利用免疫细胞化学的实验方法进行机制方面的探索。
研究结果：第一部分紫外吸收剂UV-9对小鼠青春期乳腺干细胞影响的即时效应结果显示，0.2mg/kg，200mg/kg的剂量组均不影响乳腺导管生长发育的速度，200mg/kg的剂量组导致小鼠乳腺末端芽的数量增加，0.2mg/kg的剂量组增加了乳腺导管增生的比例。流式分选结果表明，两个剂量组均显著性降低基底细胞占总上皮细胞的比例。后续的干细胞体外培养的实验结果显示，0.2mg/kg的处理组增强了乳腺管腔干细胞的微球形成能力，以及3D直径的大小，200mg/kg的剂量组降低了乳腺微球的形成能力以及3D直径的大小。免疫组化结果表明，只有0.2mg/kg的剂量组提升了Ki67的表达水平，同时降低了ERα的表达水。滞后效应的结果表明，0.2mg/kg，200mg/kg的处理组与对照组相比均没有显著性的影响，说明不会对乳腺的发育造成永久性损伤的结果。第二部分紫外吸收剂UV-9对不同ER敏感型乳腺癌干细胞的结果显示，紫外吸收剂UV-9可以增强ER+的细胞系的活性，降低ER-的细胞系的活性。在划痕实验的结果中，紫外吸收剂UV-9促进ER+的细胞系的迁移能力，对ER-的细胞系的迁移能力没有显著性影响。免疫细胞化学的实验结果显示经紫外吸收剂UV-9处理之后降低ER+的细胞的Caspase3的蛋白水平，增强ER-的细胞的Caspase3蛋白表达水平，同时均不影响PCNA蛋白的表达水平。在免疫组化的实验结果中，经E2和紫外吸收剂UV-9处理之后都表现出ERα蛋白水平下降的现象，说明紫外吸收剂UV-9具有雌激素的活性。在Aqp1的免疫细胞化学实验中，紫外吸收剂UV-9在处理乳腺癌干细胞形成微球的过程中上调了ER+的细胞Apq1的表达。在Aqp1作用途径的结果显示可能不通过p38-MAPK的信号通路进行作用。
研究结论：紫外吸收剂UV-9对小鼠青春期乳腺干细胞即时效应的结果显示，200mg/kg的剂量组增加了小鼠乳腺末端芽的数量，0.2mg/kg的剂量组引起乳腺导管的异常增生，两个剂量组同时降低基底细胞占总上皮细胞的比例说明对基底干细胞有损伤的作用；0.2mg/kg的剂量组提升乳腺管腔干细胞的增殖性能，200mg/kg的剂量组使乳腺管腔干细胞的增殖性能降低。免疫组化的结果显示紫外吸收剂UV-9可能通过改变雌激素受体的表达水平来发挥作用。在滞后效应的结果中，处理组和对照组相比均没有显著性的变化。紫外吸收剂UV-9对不同ER敏感型乳腺癌干细胞的影响的结果显示，紫外吸收剂UV-9具有类雌激素的作用可通过下调Caspase3的表达抑制凋亡的产生促进乳腺癌的发生发展，与此同时可促进水通道蛋白Aqp1的表达来参与癌症的发生和发展。本实验的研究结果可为紫外吸收剂UV-9的使用做一个安全的评估，以及为后续的研究提供依据。