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自交不亲和是一种种内生殖障碍，对促进种间生殖障碍形成和物种分化意义重大，这种特性存在于约40％的被子植物中，并多次独立起源，与地球上被子植物高度物种多样性和适应性的形成和维持密切相关。目前研究比较清楚的被子植物自交不亲和类型有如下三类:十字花科的孢子体自我识别类型、罂粟科的配子体自我识别类型和基于核糖核酸酶的配子体非自我识别类型（茄科、蔷薇科和车前草科）。石斛属是兰科最大的属之一，有72％的物种具有自交不亲和性，而兰科物种仅有不到10％的物种具有这种特性，其占兰科已报道自交不亲和物种的近一半;但前人对其研究仅停留在对个别物种的自交不亲和形态调查上。那么石斛属物种的自交不亲和形态是怎样的，它们的演化式样又是怎样的？石斛属自交不亲和物种的分子基础是什么？它们可能的作用机制又是什么？本研究通过对26个石斛属物种的结实率统计分析和对13个自交不亲和代表物种的花粉管荧光显微镜观察，对该属物种自交和异交授粉亲和性的系统祖先重建分析，对两个典型自交不亲和物种的转录组以及四个兰科基因组与已知自交不亲和类型关键基因进行同源鉴定分析和以石斛属自交不亲和代表物种束花石斛的组学分析来探讨和回答以上问题。对以上问题的探讨和回答对理解石斛属乃至兰科植物的自交不亲和的发生式样、分子基础和进化机制具有重大意义;同时也为解释兰科植物多样性提供了新的可能的视角。 1.石斛属自交不亲和形态类型鉴定及其系统演化式样 对26个石斛属物种进行了连续两年的自交和异交人工授粉试验，对不同物种自交和异交授粉后，观察和统计花期和结实率，并按照一定的时间间隔取样，使用荧光显微镜对其花粉管的萌发和生长情况进行观察分析。结果表明，石斛属中存在多种自交不亲和类型，从结实率的统计角度，石斛属中存在自交不结实异交结实物种，如:束花石斛、聚石斛、长距石斛（云南）等;自交和异交均不结实物种，如:长距石斛（深圳）、齿瓣石斛等;部分自交不结实物种，如:铁皮石斛、苏瓣石斛、重唇石斛、海南石斛、晶帽石斛等。从对花粉管萌发生长的观察结果分析，石斛属中存在多种自交不亲和类型，1、花粉管生长停止在花柱上半部分，如:束花石斛、长距石斛（云南）、密花石斛等;2、自交和异交授粉的花粉管萌发和生长并无明显差异，只是在花粉管即将或刚进入子房时，自交的花粉管开始出现黑斑，且随着时间的延长，黑斑面积越来越大，直到花粉管最后消失，如:小黄花石斛、聚石斛、细叶石斛;3、花粉管被膜状体包被阻碍花粉管萌发生长，如:长距石斛（深圳）;4、自交花粉管生长到花柱的顶端，开始出现黑斑，之后黑斑面积越来越大，如:独角石斛和齿瓣石斛等。 通过对石斛属授粉亲和性的系统分布分析，本研究发现第一种花粉管自交不亲和类型分布最广，是石斛属的主要自交不亲和类型，属于配子体自交不亲和类型。 2.兰科中S-RNase GSI分子机制的同源性研究 利用兰科转录组（束花石斛和长距石斛）和基因组（深圳拟兰、深圳香荚兰、铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰）信息进行基于核糖核酸酶类型自交不亲和基因的同源鉴定，结合系统发育树信息发现兰花中不存在基于核糖核酸酶类型的自交不亲和的同源基因，说明兰科植物不具备这种自交不亲和机制;并进一步推测基于核糖核酸酶类型自交不亲和的起源:出现在单子叶与双子叶植物分化之后。 3.束花石斛自交不亲和分子基础探究 通过对束花石斛自交和异交人工授粉后，取不同时间段的花柱，并用叶子和未授粉的同时期的花柱和花粉作为对照，进行转录组分析。结果显示:束花石斛中鉴定了几个参与自交不亲和反应的候选基因，分别是:参与花粉壁代谢的果胶酯酶、质膜上钙离子运输ATP酶、NAC结构域蛋白、生长素和乙烯合成代谢通路关键酶、锌指蛋白、膜受体CrRLK1L基因家族和分泌蛋白RALF基因家族。结合花柱、花粉特异基因分析和加权基因共表达网络分析，提出了束花石斛自交不亲和的假说:花柱特异表达基因TRINITY_DN31133_c0_g1_i2（编码锌指蛋白）通过与花柱特异表达基因Dch2_RALF的强力互作，调控Dch2_RALF和花粉受体Dch ANX1/2的互作进而影响花粉管的破裂。对以上涉及植物激素的分析结果进行了植物激素（IAA和ACC）浓度检测验证分析，发现生长素、乙烯存在与自交不亲和反应紧密相关的浓度变化。 本文结合传粉生物学、分子生物学和生物信息学等方法，从花粉管形态层面，揭示石斛属存在多种自交不亲和类型及其系统分布式样;提出兰科中不存在与核糖核酸酶自交不亲和类型类似的分子机制，同时也提出核糖核酸酶自交不亲和起源于单子叶和双子叶分化之后，菊亚纲和蔷薇亚纲分化之前;提出束花石斛自交不亲和假说。本研究提供了解释兰科物种多样性形成和维持的新视角，也为石斛属乃至兰科杂交育种提供理论指导。