论文部分内容阅读
V(D)J重排是适应性免疫系统获得多样性的主要分子机制，因而也被视为适应性免疫系统的定义性特征。针对不同物种的适应性免疫系统进行比较研究发现，V(D)J重排的出现是适应性免疫系统约5亿年前在有颌鱼类中起源的关键性事件。V(D)J重排由仅在淋巴细胞中表达的RAG1和RAG2所介导。 我们关于RAG2的研究，主要围绕两个科学问题展开:首先，RAG2非核心区的功能及其突变与联合免疫缺陷疾病(SCID)的关系。第二个问题是，保守的适应性免疫系统是否存在进化以及如何发生。 在第一部分工作中，我们将RAG2的非核心区作为一个整体来研究其功能。我们发现RAG2的非核心区从低等物种到高等物种十分保守，其中，锌指结构中与锌离子结合的八个氨基酸在100个物种中从未发生变化。RAG2-C478Y突变发生在一个与锌离子结合的氨基酸上，而且已在两例严重联合免疫缺陷病人中被报道。通过构建的RAG2-C478Y基因敲入小鼠模型，我们发现C478Y突变将导致RAG2的蛋白质不稳定，从而造成该小鼠淋巴细胞中的V(D)J重排效率下降和T，B细胞发育受阻。结合其它的点突变实验，我们认为锌指结构对于RAG2的蛋白质稳定性是至关重要的。此外，另一个位于RAG2的非核心区域且与C478相邻的点突变N474S却不会影响RAG2的稳定性或抑制淋巴细胞的发育，这佐证了我们的观点，即锌指结构对于RAG2的蛋白稳定性和V(D)J重排是重要的。以上的结果表明，破坏RAG2非核心区的锌指结果会导致RAG2的蛋白不稳定和免疫缺陷。 在第二部分工作中，我们以RAG2的进化为切入点研究了保守的适应性免疫系统从低等物种到高等物种的进化问题。斑马鱼RAG2(DaR2)在293T细胞中与小鼠RAG2(MmR2)相比表现出重排效率的显著下降。但是与MmR2相比，DaR2在表达量和入核方面没有明显的缺陷。DaR2与MmR2的表达差异提示DaR2较低的重排效率可能是由于它的结构异常所致。在pro-B细胞中，DaR2的表达量与MmR2相比明显下降。DaR2在pro-B细胞中并不会如同结构破坏的MmR2-C478Y一样被完全降解，而且DaR2的降解是T490依赖的。但是，仅仅通过T490A抑制周期性降解无法完全回复DaR2的表达缺陷。不同物种的RAG2在pro-B中的表达量与物种体温存在正相关性。意料之外的是，低温培养(28℃)可以完全回复DaR2的表达缺陷，而DaR1相对MmR1的低表达则不能被低温培养所回复。进一步的研究表明DaR2在高温(37℃)时比MmR2更不稳定。以上数据说明RAG2的热稳定性从低等物种到高等物种发生了进化。另一方面，DaR2基因敲入小鼠模型表明，如果RAG2不发生进化，不仅会引起重排的准确性下降，而且会抑制V(D)J重排效率，导致免疫缺陷。