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目的:本课题通过过氧化氢(H2O2)诱导体外培养的大鼠眼小梁网细胞(TMCs)氧化损伤,利用α-硫辛酸(α-LA)对氧化应激的小梁网细胞进行干预,观察TMCs形态学变化,检测细胞中核转录因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达改变,研究氧化应激、NF-κB、TNF-α在原发性开角型青光眼(POAG)发病机制中的作用和α-LA对TMCs氧化损伤的保护作用,以期为临床青光眼防治提供新思路.
方法:大鼠TMCs体外原代培养,免疫组织化学法染色鉴定[1].取传至第3代生长良好的TMCs按2×105/ml消化转入6孔培养板饥饿过夜培养.随机分为五组,A组为正常对照组,B组为H2O2处理组,C1、C2、C3组为三个不同浓度α-LA组.将各组TMCs放入5%CO2培养箱,于37℃下培养2h.光学显微镜下观察TMCs形态学变化,免疫组化法及Real-timePCR法检测并比较各组NF-κB以及TNF-α的表达变化.
结果:
1.原代培养成功的TMCs呈三角形、梭形或不规则形,细胞逐渐生长融合,10天左右呈单层旋涡状,传至第三代时细胞较稳定,细胞呈梭形,胞质多,颗粒丰富,有许多分枝和突起.取第三代的细胞行免疫组织化学法鉴定Anti-FN、Anti-LN、Anti-NES,呈阳性反应,胞质呈棕黄色(阳性),阴性对照胞质未染色,与TMCs特性吻合.
2.各组TMCs形态学比较:A组呈正常小梁网形态;B组细胞突起减少,细胞皱缩,数量减少,细胞间隙增宽;而C1、C2、C3组随着α-LA浓度的增加,细胞形态逐渐接近至正常对照组.
3.各组TMCs中NF-κB的表达有显著统计学差异(F=398.431,P=0.000).A组小梁网细胞质表达少量NF-κB;B组小梁网细胞NF-κB大量活化表达于细胞核,较A组相比明显升高(P=0.000);C组小梁网细胞胞质、胞核中均有NF-κB表达,与B组比较,NF-κBmRNA表达量降低(P分别为0.012,0.000,0.000);C1,C2,C3两两比较均有统计学意义,C2与C1比较NF-κBmRNA降低(P=0.001)、C3与C1组比较明显降低(P=0.000),C3与C2组比较降低(P=0.000);C1、C2组与A组相比有统计学差异,NF-κBmRNA仍然偏高(P=0.000),与A组相比C3组无统计学意义(p=0.360).
4.各组TMCsTNF-α均呈阳性表达于胞质,表达量有显著统计学差异(F=86.304,P=0.000).A组少量表达TNF-αmRNA;与A组相比B组表达升高(P=0.000);C1、C2、C3组与B组相比表达均下降(P分别为0.002,0.000,0.000);随着α-LA浓度的增加,C1、C2、C3三组TNF-αmRNA的表达量逐渐下降,两两相比均有显著统计学差异(P均为0.000);C3组与A组比较无显着差异(p=0.338);
结论:
1.氧化应激使TMCs形态学改变,细胞丢失,数量减少.NF-κB大量活化进入细胞核,通过NF-κB/TNF-α反馈环路,介导TMCs氧化损伤;
2.α-LA能抑制NF-κB活化,使TNF-α通过包括NF-κB/TNF-α反馈环路在内的途径分泌减少,发挥抗氧化作用,减轻TMCs氧化损害;
3.α-LA对NF-κB和TNF-α表达抑制呈浓度依赖性,浓度为1000μM的α-LA可使氧化损伤的TMCs趋于正常,推测1000μM的α-LA可阻断800μMH2O2诱导的小梁网细胞的损伤.
方法:大鼠TMCs体外原代培养,免疫组织化学法染色鉴定[1].取传至第3代生长良好的TMCs按2×105/ml消化转入6孔培养板饥饿过夜培养.随机分为五组,A组为正常对照组,B组为H2O2处理组,C1、C2、C3组为三个不同浓度α-LA组.将各组TMCs放入5%CO2培养箱,于37℃下培养2h.光学显微镜下观察TMCs形态学变化,免疫组化法及Real-timePCR法检测并比较各组NF-κB以及TNF-α的表达变化.
结果:
1.原代培养成功的TMCs呈三角形、梭形或不规则形,细胞逐渐生长融合,10天左右呈单层旋涡状,传至第三代时细胞较稳定,细胞呈梭形,胞质多,颗粒丰富,有许多分枝和突起.取第三代的细胞行免疫组织化学法鉴定Anti-FN、Anti-LN、Anti-NES,呈阳性反应,胞质呈棕黄色(阳性),阴性对照胞质未染色,与TMCs特性吻合.
2.各组TMCs形态学比较:A组呈正常小梁网形态;B组细胞突起减少,细胞皱缩,数量减少,细胞间隙增宽;而C1、C2、C3组随着α-LA浓度的增加,细胞形态逐渐接近至正常对照组.
3.各组TMCs中NF-κB的表达有显著统计学差异(F=398.431,P=0.000).A组小梁网细胞质表达少量NF-κB;B组小梁网细胞NF-κB大量活化表达于细胞核,较A组相比明显升高(P=0.000);C组小梁网细胞胞质、胞核中均有NF-κB表达,与B组比较,NF-κBmRNA表达量降低(P分别为0.012,0.000,0.000);C1,C2,C3两两比较均有统计学意义,C2与C1比较NF-κBmRNA降低(P=0.001)、C3与C1组比较明显降低(P=0.000),C3与C2组比较降低(P=0.000);C1、C2组与A组相比有统计学差异,NF-κBmRNA仍然偏高(P=0.000),与A组相比C3组无统计学意义(p=0.360).
4.各组TMCsTNF-α均呈阳性表达于胞质,表达量有显著统计学差异(F=86.304,P=0.000).A组少量表达TNF-αmRNA;与A组相比B组表达升高(P=0.000);C1、C2、C3组与B组相比表达均下降(P分别为0.002,0.000,0.000);随着α-LA浓度的增加,C1、C2、C3三组TNF-αmRNA的表达量逐渐下降,两两相比均有显著统计学差异(P均为0.000);C3组与A组比较无显着差异(p=0.338);
结论:
1.氧化应激使TMCs形态学改变,细胞丢失,数量减少.NF-κB大量活化进入细胞核,通过NF-κB/TNF-α反馈环路,介导TMCs氧化损伤;
2.α-LA能抑制NF-κB活化,使TNF-α通过包括NF-κB/TNF-α反馈环路在内的途径分泌减少,发挥抗氧化作用,减轻TMCs氧化损害;
3.α-LA对NF-κB和TNF-α表达抑制呈浓度依赖性,浓度为1000μM的α-LA可使氧化损伤的TMCs趋于正常,推测1000μM的α-LA可阻断800μMH2O2诱导的小梁网细胞的损伤.