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Wnt信号在多细胞生物的发育、细胞的增殖分化、干细胞的自我更新和细胞运动等方面发挥着关键的作用，该信号一旦发生异常就会导致人类癌症和炎性疾病的发生。Wnt信号通路十分古老且在生物进化过程中高度保守，主要包括经典信号通路以及非经典信号通路两大类。由于Ca2+的释放是第一个被描述的非典型途径的特征，因此研究Wnt/Ca2+非经典途径是探明Wnt非经典通路作用机制的基础。Wnt/Ca2+信号通路激活后能刺激细胞质内的Ca2+升高，Ca2+通过与钙调蛋白(Calmodulin, CaM)结合进而激活下游激酶，参与调节生物体发育、癌症发生及免疫应答中淋巴细胞中促炎基因的表达等生物学过程。Wnt信号通路在高等动物中已被普遍研究，但其在海洋无脊椎动物中的研究仍较为粗浅，而且非经典途径相比于经典途径则更少被关注。因此，本研究采用软体动物长牡蛎(Crassostrea Gigas)为研究对象，利用生物信息学等相关技术从长牡蛎基因组中筛选了响应LPS刺激的CgWnt-1基因和CgCaM基因，探究了两个基因的分子结构、进化特征。此外，利用分子生物学和细胞生物学等相关技术探究了它们的表达特征以及在免疫应答中的功能，主要取得的研究结果如下：
1.LPS刺激后，长牡蛎血淋巴细胞中CgWnt-1的mRNA表达量显著增加，胞内Ca2+浓度升高
CgWnt-1基因开放阅读框全长1134bp，该开放阅读框能编码含377个氨基酸的蛋白。蛋白结构域分析发现CgWnt-1在1-20个氨基酸处存在一个信号肽，在54-377氨基酸处存在一个WNT-1结构域。多序列对比结果显示，CgWnt-1与脊椎动物和无脊椎动物的WNT-1结构域具有50%以上的相似性，与美洲巨蛎(C. virginica)的Wnt-1相似度最高，达70.3%。CgWnt-1的mRNA在不同组织中(唇瓣，肌肉，鳃，外套膜，肝脏和血细胞)呈组成型分布，在外套膜中表达量最高，唇瓣中最低。LPS刺激体外培养长牡蛎原代血细胞，发现CgWnt-1的mRNA表达量以及细胞内Ca2+浓度在3h后均显著上升(p＜0.05)，分别为对照组的7.33倍和1.57倍。
2.LPS刺激后CgCaM的mRNA表达水平在长牡蛎血淋巴细胞中显著降低，CgIL17-1的mRNA表达水平显著增加。
CgCaM基因的开放阅读框为471bp，该开放阅读框能编码含156个氨基酸残基的蛋白。蛋白结构域分析发现CgCaM一共包含4个重复且保守的EFh结构域，分别在0-38，48-74，82-110和118-146个氨基酸处。多序列对比结果显示，CgCaM的氨基酸序列与无脊椎动物的CaM具有45%-57%的相似性，其中，与美洲巨蛎(C. virginica)相似性最高，达57.6%。系统发育树结果表明CgCaM与美洲巨蛎的亲缘关系最近，与软体动物聚为一支。CgCaM的mRNA在不同组织中(唇瓣，性腺，肌肉，鳃，外套膜，肝脏和血细胞)呈组成型分布，在血细胞中表达量最高，在性腺中表达量最低。LPS刺激体外培养长牡蛎原代血细胞，发现CgCaMmRNA表达量在3h后显著下调(p＜0.05)，为对照组的0.34倍。此外，长牡蛎炎症因子CgIL17-1的mRNA的表达量在LPS刺激后3h和6h显著升高，分别为0小时的4.87倍和10.30倍(p＜0.05)，而在免疫应答24小时后显著下降，为对照组的2.84倍(p＜0.05)。
3.免疫应答中miRNAscaffold659_26519可以抑制CgCaM的表达，进而可能通过Wnt/Ca2+通路调节炎症因子CgIL17-1的表达。
从转录组中筛选出能靶定CgCaM转录本的miRNAscaffold659_26519，体外双荧光实验结果表明，scaffold659_26519能靶定CgCaM的3’-UTR区并抑制CgCaM的表达。对长牡蛎原代血淋巴细胞进行LPS免疫刺激，发现CgIL17-1的表达量在刺激后3h-6h显著上升，分别为0h的4.87倍和10.30倍(p＜0.05)，scaffold659_26519的表达水平也在刺激后3h-6h显著上调，分别为对照组的43.52倍和56.40倍(p＜0.05)。体外敲减scaffold659_26519表达后，westerblot结果表明CgCaM蛋白水平的表达量在LPS刺激后有显著提高，CgCaM对应的条带明显变粗，但血淋巴细胞中CgIL17-1的mRNA表达水平显著降低，为对照组的0.58倍(p＜0.05)。研究结果表明，免疫应答早期高表达的miRNAscaffold659_26519抑制了CgCaM的表达，进而影响了Wnt/Ca2+通路对CgIL17-1表达的调节作用。
以上研究结果表明，长牡蛎Wnt信号通路中的CgWnt-1分子和CgCaM分子在序列特征和蛋白结构上高度保守；CgWnt-1和CgCaM在成体组织中呈组成型表达；CgWnt-1能够响应LPS刺激后的免疫应答，表达量上调，而CgCaM表达量下调；此外，LPS刺激后早期细胞内Ca2+浓度、CgWnt-1以及CgIL17-1的表达量均上调说明LPS可能激活了Wnt/Ca2+途径参与调节长牡蛎的炎症反应。同时，miRNAscaffold659_26519可以直接靶定CgCaM的3’-UTR区，并且能响应LPS的刺激，进而调节CgCaM的表达；当scaffold659_26519被抑制后CgCaM表达量增加，CgIL17-1mRNA表达水平下调，推测miRNA的敲减可能抑制了Wnt/Ca2+途径参与调节长牡蛎的炎症反应。以上这些研究结果在细胞和分子水平丰富了当前对长牡蛎炎症免疫应答过程中调节机制的研究，为深入探究海洋无脊椎动物miRNA参与调节WNT/Ca2+信号通路的激活机制奠定了基础。
1.LPS刺激后，长牡蛎血淋巴细胞中CgWnt-1的mRNA表达量显著增加，胞内Ca2+浓度升高
CgWnt-1基因开放阅读框全长1134bp，该开放阅读框能编码含377个氨基酸的蛋白。蛋白结构域分析发现CgWnt-1在1-20个氨基酸处存在一个信号肽，在54-377氨基酸处存在一个WNT-1结构域。多序列对比结果显示，CgWnt-1与脊椎动物和无脊椎动物的WNT-1结构域具有50%以上的相似性，与美洲巨蛎(C. virginica)的Wnt-1相似度最高，达70.3%。CgWnt-1的mRNA在不同组织中(唇瓣，肌肉，鳃，外套膜，肝脏和血细胞)呈组成型分布，在外套膜中表达量最高，唇瓣中最低。LPS刺激体外培养长牡蛎原代血细胞，发现CgWnt-1的mRNA表达量以及细胞内Ca2+浓度在3h后均显著上升(p＜0.05)，分别为对照组的7.33倍和1.57倍。
2.LPS刺激后CgCaM的mRNA表达水平在长牡蛎血淋巴细胞中显著降低，CgIL17-1的mRNA表达水平显著增加。
CgCaM基因的开放阅读框为471bp，该开放阅读框能编码含156个氨基酸残基的蛋白。蛋白结构域分析发现CgCaM一共包含4个重复且保守的EFh结构域，分别在0-38，48-74，82-110和118-146个氨基酸处。多序列对比结果显示，CgCaM的氨基酸序列与无脊椎动物的CaM具有45%-57%的相似性，其中，与美洲巨蛎(C. virginica)相似性最高，达57.6%。系统发育树结果表明CgCaM与美洲巨蛎的亲缘关系最近，与软体动物聚为一支。CgCaM的mRNA在不同组织中(唇瓣，性腺，肌肉，鳃，外套膜，肝脏和血细胞)呈组成型分布，在血细胞中表达量最高，在性腺中表达量最低。LPS刺激体外培养长牡蛎原代血细胞，发现CgCaMmRNA表达量在3h后显著下调(p＜0.05)，为对照组的0.34倍。此外，长牡蛎炎症因子CgIL17-1的mRNA的表达量在LPS刺激后3h和6h显著升高，分别为0小时的4.87倍和10.30倍(p＜0.05)，而在免疫应答24小时后显著下降，为对照组的2.84倍(p＜0.05)。
3.免疫应答中miRNAscaffold659_26519可以抑制CgCaM的表达，进而可能通过Wnt/Ca2+通路调节炎症因子CgIL17-1的表达。
从转录组中筛选出能靶定CgCaM转录本的miRNAscaffold659_26519，体外双荧光实验结果表明，scaffold659_26519能靶定CgCaM的3’-UTR区并抑制CgCaM的表达。对长牡蛎原代血淋巴细胞进行LPS免疫刺激，发现CgIL17-1的表达量在刺激后3h-6h显著上升，分别为0h的4.87倍和10.30倍(p＜0.05)，scaffold659_26519的表达水平也在刺激后3h-6h显著上调，分别为对照组的43.52倍和56.40倍(p＜0.05)。体外敲减scaffold659_26519表达后，westerblot结果表明CgCaM蛋白水平的表达量在LPS刺激后有显著提高，CgCaM对应的条带明显变粗，但血淋巴细胞中CgIL17-1的mRNA表达水平显著降低，为对照组的0.58倍(p＜0.05)。研究结果表明，免疫应答早期高表达的miRNAscaffold659_26519抑制了CgCaM的表达，进而影响了Wnt/Ca2+通路对CgIL17-1表达的调节作用。
以上研究结果表明，长牡蛎Wnt信号通路中的CgWnt-1分子和CgCaM分子在序列特征和蛋白结构上高度保守；CgWnt-1和CgCaM在成体组织中呈组成型表达；CgWnt-1能够响应LPS刺激后的免疫应答，表达量上调，而CgCaM表达量下调；此外，LPS刺激后早期细胞内Ca2+浓度、CgWnt-1以及CgIL17-1的表达量均上调说明LPS可能激活了Wnt/Ca2+途径参与调节长牡蛎的炎症反应。同时，miRNAscaffold659_26519可以直接靶定CgCaM的3’-UTR区，并且能响应LPS的刺激，进而调节CgCaM的表达；当scaffold659_26519被抑制后CgCaM表达量增加，CgIL17-1mRNA表达水平下调，推测miRNA的敲减可能抑制了Wnt/Ca2+途径参与调节长牡蛎的炎症反应。以上这些研究结果在细胞和分子水平丰富了当前对长牡蛎炎症免疫应答过程中调节机制的研究，为深入探究海洋无脊椎动物miRNA参与调节WNT/Ca2+信号通路的激活机制奠定了基础。