长牡蛎UPR通路基因CgATF6β与CgEIF2AK3参与调节细胞程序性死亡的初步研究

• 作 者: 刘淑静
• 机 构: 大连海洋大学
• 出 处: 大连海洋大学
• 发表日期: 2020年4期
• 关键词: 长牡蛎

免疫细胞的内环境稳态对机体抵御病原菌入侵至关重要。内质网稳态是维持免疫细胞物质代谢的关键，在调节蛋白质和代谢酶的合成中发挥重要作用。在不利环境下，扰乱内质网稳态，诱发内质网压力。真核生物进化出保守的非折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response, UPR)去增强蛋白质的折叠，如果内质网压力仍然不能及时缓解，将导致细胞凋亡和自噬的产生。其中，激活转录因子6(Activating Transcription Factor 6, ATF6)和蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like ER kinase, PERK)是UPR通路中重要的内质网跨膜感受器。本研究克隆了长牡蛎(Crassostrea gigas)ATF6(命名为CgATF6β)基因和PERK(命名为CgEIF2AK3)基因，分析了其分子序列和组织分布特征，初步研究了UPR在应对内质网压力中的生物学功能。
　　CgATF6β基因cDNA全长为2645bp，开放阅读框(Open reading frame, ORF)为1596bp，编码531个氨基酸。CgATF6β蛋白具有一个跨膜结构域、一个保守的亮氨酸拉链结构域、一个丝氨酸蛋白酶-1(S1P)剪切位点和一个金属蛋白酶-2(S2P)剪切位点。CgATF6βmRNA在长牡蛎的血淋巴细胞、鳃、外套膜、性腺、肝胰腺和唇瓣等组织中均有表达。血淋巴细胞中的CgATF6β在灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激后3小时显著升高(p＜0.01)，12小时达到峰值(p＜0.01)。CgATF6β蛋白在灿烂弧菌刺激后1.5小时，检测到其具有明显的从细胞质转位入细胞核现象。对CgATF6β基因进行体内干扰后，在灿烂弧菌刺激后，长牡蛎血淋巴细胞中的葡萄糖调节蛋白78(CgGRP78)、钙联接蛋白(CgCNX)和抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤2(CgBcl-2)等基因的mRNA表达量显著降低(p＜0.01)，而自噬基因Beclin1(CgBeclin1)和自噬相关基因5(CgATG5)的mRNA转录水平和凋亡比率均显著升(p＜0.05)。上述结果提示CgATF6β参与调节细胞凋亡和自噬用于应对病原菌的入侵。
　　CgEIF2AK3基因的ORF为3174bp，编码1057个氨基酸。。CgEIF2AK3蛋白包含一个跨膜结构域，两个保守的氨基酸激酶结构域，以及保守的618位赖氨酸与980位苏氨酸磷酸化位点。CgEIF2AK3mRNA在长牡蛎的各组织中均有表达，并且在血淋巴细胞中的表达量最高。CgEIF2AK3蛋白主要分布在长牡蛎血淋巴细胞的细胞质中。对长牡蛎进行poly(I:C)免疫，血淋巴细胞中的CgEIF2AK3mRNA表达量在48小时显著升高(p＜0.05)。对CgEIF2AK3进行体内干扰或抑制剂处理后，同时给予poly(I:C)免疫，长牡蛎血淋巴细胞中的自噬相关基因12(CgATG12)的mRNA表达量显著下调(p＜0.05)，自噬小体比率和血淋巴细胞总数显著下调(p＜0.01)，提示CgEIF2AK3能响应病毒入侵并参与调控细胞自噬的发生。
　　以上研究结果表明，CgATF6β和CgEIF2AK3分别通过调控凋亡和自噬参与应对病原的入侵，维持多细胞生物的稳态。研究结果为深入探索软体动物UPR信号通路相关分子在维持内质网稳态中的作用提供参考。