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赤星病是危害烟草栽培生产中最为严重的侵染性病害之一，在我国烟草主要产区均会不定时发生，严重影响了我国烟草的规模化栽培生产和烟叶品质。因此，阐明赤星病的侵染机制，解析出关键致病内因，找出彻底根治的技术和策略，已经成为烟草赤星病防治体系构建中的重要环节。本研究选择赤星病的核心病原长柄链格孢菌（Alternaria longipes）和模式植物本氏烟草（Nicotiana benthamiana）作为研究材料，通过对长柄链格孢菌侵染部位、时间和方法等关键侵染参数优化，构建出基于离体本氏烟草叶片的长柄链格孢菌侵染体系。以此为基础，对长柄链格孢菌侵染发生过程中叶片表型、生理生化等关键指标进行定量和定性测定，界定出长柄链格孢菌侵染关键时间节点。同时，利用RNA-Seq和miRNA-Seq技术鉴定出长柄链格孢菌侵染关键节点叶内特异响应基因和miRNAs，并用qPCR技术分析整个侵染过程中关键基因和对于调控miRNAs的响应特征。此外，利用STTM方法对长柄链格孢菌特异响应miRNAs进行了瞬时沉默，确证侵染过程中关键miRNAs和基因的功能。本研究最终从转录和转录后调控水平上勾勒出长柄链格孢菌与烟叶细胞互作过程中发生的关键分子事件。主要研究结果如下：
（1）长柄链格孢菌侵染对烟草叶片生理生化特性的影响。
为了详细了解长柄链格孢菌侵染对烟草生理生化的影响，并鉴定出长柄链格孢菌侵染的关键时间节点，对整个侵染过程不同时间点的叶片表型变化、细胞死亡率、关键生理生化指标进行了定性和定量分析。结果发现在接种长柄链格孢菌3d，叶片开始出现侵染症状，侵染点附近出现细胞凋亡，随着侵染进程的继续，侵染症状加深。对比侵染叶和对照叶内活性氧和抗氧化体系差异，发现随着侵染进程推进，侵染叶内MDA总体上明显高于对照，相应SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性也出现升高。同时，分析侵染叶和对照叶关键抗逆激素差异，发现侵染显著促进了ETH、JA、SA、ABA等4种关键激素积累，其中，ETH积累最为明显。此外，对比分析可溶性蛋白及可溶性糖等细胞内重要营养物质差异，发现长柄链格孢菌侵染影响了蛋白和糖类代谢。综合表型、生理等指标变化，发现长柄链格孢菌侵染诱发了细胞抗逆响应，促发了ROS、大量抗逆激素以及抗逆酶的累积和响应。随着侵染持续进行，也加剧了细胞内ROS的积累，膜脂过氧化加重，细胞死亡率加重，其中，发现叶片接种后3d，上述各种生理生化指标开始在侵染叶和对照叶出现显著差异，表明侵染后3d为长柄链格孢菌侵染关键时间节点。
（2）响应长柄链格孢菌侵染特异响应基因的筛选和鉴定。
为了筛选和鉴定出本氏烟叶内响应长柄链格孢菌侵染的特异响应基因，利用RNA-Seq技术对侵染后3d的对照（BCK）和侵染处理（AT）叶片进行了转录组测序，各设3个生物学重复。结果6个样品经过质量过滤后，获得了35,041,398、33,863,712、36,101,574、33,882,968、33,449,394、34,851,806个clean reads。分别将clean reads与本氏烟草基因组和长柄链格孢菌基因组比对判定侵染叶内转录本是否受到长柄链格孢菌的沾染，结果6个样品绝大部分clean reads可以有效匹配到本氏烟草基因组，只有极少数reads匹配长柄链格孢菌基因组。表明本研究有效排除了病原菌的干扰。利用hisat2结合stringtie软件对所有转录本进行定量分析和新转录本组装，结果显示侵染和对照样品内共鉴定到106,472个转录本，其中，49,332个为新预测转录本。进一步利用EdgeR、Limma-Voom和DESeq23种方法对侵染和对照样品进行显著差异分析，结果显示3种方法共同鉴定1269个DEGs，长柄链格孢菌侵染处理中上调978个，下调有291个。通过对1269个差异基因进行详细功能富集分析结合手动功能注释，发现长柄链格孢菌侵染激活了细胞内钙信号、激素信号、免疫体系等关键细胞进程。
（3）响应长柄链格孢菌侵染特异miRNAs的筛选和鉴定。
为了鉴定和筛选影响侵染进程关键调控miRNAs清单，同步对侵染后3d的侵染叶和空白处理叶进行sRNA测序，各设3个重复。结果6个样品分别获得10,306,311、11,359,736、10,203,587、15,192,301，9,307,253、15,017,613个clean reads。分别使用MIRPDP2和miR-PREFeR鉴定长柄链格孢菌侵染下本氏烟草基因组miRNA表达位点。结果2个软件共同鉴定得到89个miRNAs，其中，有68个保守的miRNAs，21个新型miRNAs。利用EdgeR、Limma-Voom、DESeq23种统计分析方法对侵染和对照叶片miRNAs进行差异分析，结果3种软件共同鉴定11个显著差异miRNAs，其中，长柄链格孢菌处理中显著上调8个，下调3个。对显著差异miRNAs靶基因进行预测，发现长柄链格孢菌侵染后显著上调miRNAs靶向了抗病蛋白、乙烯、抗氧化酶等关键免疫和抗逆响应进程。进一步分析长柄链格孢菌侵染特异响应miRNAs及靶基因在整个侵染进程中表达模式变化，发现病原菌通过激活宿主细胞体内特异响应miRNAs，来间接控制植物免疫响应。此外，发现tsRNAs（tRNA-derived sRNAs）也可能参与了长柄链格孢菌侵染响应。
（4）响应长柄链格孢菌特异调控miRNAs的功能确证。
为了进一步明确长柄链格孢菌特异响应miRNAs的功能，研究中构建并优化了离体叶片长效瞬时表达载体，并结合STTM技术对本氏烟草离体叶片长柄链格孢菌特异响应的Nbe-miR482、Nbe-miR2031进行沉默。同时，对沉默和空白对照叶片分别进行接菌处理，并分析接种后沉默后叶片内miRNAs及靶基因表达水平，进一步评测Nbe-miR482和Nbe-miR2031在长柄链格孢菌侵染中功能。结果发现分别沉默Nbe-miR482和Nbe-miR2031叶片内miRNAs表达明显低于未沉默叶片。同时，沉默后的叶片长柄链格孢菌感染程度明显低于未侵染叶片。这进一步证实了长柄链格孢菌与烟草细胞互作过程中，长柄链格孢菌通过调控植物体内的特异响应miRNAs来控制宿主的免疫响应，实现侵染。
总之，本研究在离体条件下通过整合响应长柄链格孢菌侵染的特异基因和miRNAs信息，同时，结合miRNAs及靶向信息的功能验证初步阐明了长柄链格孢菌侵染叶片过程中，植物体内的抗逆响应机制和调控机制。此外，解析出本氏烟草和长柄链格孢菌侵染互作过程中，长柄链格孢菌通过促发本氏烟草体内关键miRNAs信息来间接控制植物免疫响应这一关键分子事件。本研究所获取的结果为进一步深入阐述和揭示烟草赤星病的侵染机制提供了重要的基础数据信息，同时，也为从分子水平上开发出烟草赤星病抑制方法和优异的抗性资源筛选提供了重要的的参考信息。
（1）长柄链格孢菌侵染对烟草叶片生理生化特性的影响。
为了详细了解长柄链格孢菌侵染对烟草生理生化的影响，并鉴定出长柄链格孢菌侵染的关键时间节点，对整个侵染过程不同时间点的叶片表型变化、细胞死亡率、关键生理生化指标进行了定性和定量分析。结果发现在接种长柄链格孢菌3d，叶片开始出现侵染症状，侵染点附近出现细胞凋亡，随着侵染进程的继续，侵染症状加深。对比侵染叶和对照叶内活性氧和抗氧化体系差异，发现随着侵染进程推进，侵染叶内MDA总体上明显高于对照，相应SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性也出现升高。同时，分析侵染叶和对照叶关键抗逆激素差异，发现侵染显著促进了ETH、JA、SA、ABA等4种关键激素积累，其中，ETH积累最为明显。此外，对比分析可溶性蛋白及可溶性糖等细胞内重要营养物质差异，发现长柄链格孢菌侵染影响了蛋白和糖类代谢。综合表型、生理等指标变化，发现长柄链格孢菌侵染诱发了细胞抗逆响应，促发了ROS、大量抗逆激素以及抗逆酶的累积和响应。随着侵染持续进行，也加剧了细胞内ROS的积累，膜脂过氧化加重，细胞死亡率加重，其中，发现叶片接种后3d，上述各种生理生化指标开始在侵染叶和对照叶出现显著差异，表明侵染后3d为长柄链格孢菌侵染关键时间节点。
（2）响应长柄链格孢菌侵染特异响应基因的筛选和鉴定。
为了筛选和鉴定出本氏烟叶内响应长柄链格孢菌侵染的特异响应基因，利用RNA-Seq技术对侵染后3d的对照（BCK）和侵染处理（AT）叶片进行了转录组测序，各设3个生物学重复。结果6个样品经过质量过滤后，获得了35,041,398、33,863,712、36,101,574、33,882,968、33,449,394、34,851,806个clean reads。分别将clean reads与本氏烟草基因组和长柄链格孢菌基因组比对判定侵染叶内转录本是否受到长柄链格孢菌的沾染，结果6个样品绝大部分clean reads可以有效匹配到本氏烟草基因组，只有极少数reads匹配长柄链格孢菌基因组。表明本研究有效排除了病原菌的干扰。利用hisat2结合stringtie软件对所有转录本进行定量分析和新转录本组装，结果显示侵染和对照样品内共鉴定到106,472个转录本，其中，49,332个为新预测转录本。进一步利用EdgeR、Limma-Voom和DESeq23种方法对侵染和对照样品进行显著差异分析，结果显示3种方法共同鉴定1269个DEGs，长柄链格孢菌侵染处理中上调978个，下调有291个。通过对1269个差异基因进行详细功能富集分析结合手动功能注释，发现长柄链格孢菌侵染激活了细胞内钙信号、激素信号、免疫体系等关键细胞进程。
（3）响应长柄链格孢菌侵染特异miRNAs的筛选和鉴定。
为了鉴定和筛选影响侵染进程关键调控miRNAs清单，同步对侵染后3d的侵染叶和空白处理叶进行sRNA测序，各设3个重复。结果6个样品分别获得10,306,311、11,359,736、10,203,587、15,192,301，9,307,253、15,017,613个clean reads。分别使用MIRPDP2和miR-PREFeR鉴定长柄链格孢菌侵染下本氏烟草基因组miRNA表达位点。结果2个软件共同鉴定得到89个miRNAs，其中，有68个保守的miRNAs，21个新型miRNAs。利用EdgeR、Limma-Voom、DESeq23种统计分析方法对侵染和对照叶片miRNAs进行差异分析，结果3种软件共同鉴定11个显著差异miRNAs，其中，长柄链格孢菌处理中显著上调8个，下调3个。对显著差异miRNAs靶基因进行预测，发现长柄链格孢菌侵染后显著上调miRNAs靶向了抗病蛋白、乙烯、抗氧化酶等关键免疫和抗逆响应进程。进一步分析长柄链格孢菌侵染特异响应miRNAs及靶基因在整个侵染进程中表达模式变化，发现病原菌通过激活宿主细胞体内特异响应miRNAs，来间接控制植物免疫响应。此外，发现tsRNAs（tRNA-derived sRNAs）也可能参与了长柄链格孢菌侵染响应。
（4）响应长柄链格孢菌特异调控miRNAs的功能确证。
为了进一步明确长柄链格孢菌特异响应miRNAs的功能，研究中构建并优化了离体叶片长效瞬时表达载体，并结合STTM技术对本氏烟草离体叶片长柄链格孢菌特异响应的Nbe-miR482、Nbe-miR2031进行沉默。同时，对沉默和空白对照叶片分别进行接菌处理，并分析接种后沉默后叶片内miRNAs及靶基因表达水平，进一步评测Nbe-miR482和Nbe-miR2031在长柄链格孢菌侵染中功能。结果发现分别沉默Nbe-miR482和Nbe-miR2031叶片内miRNAs表达明显低于未沉默叶片。同时，沉默后的叶片长柄链格孢菌感染程度明显低于未侵染叶片。这进一步证实了长柄链格孢菌与烟草细胞互作过程中，长柄链格孢菌通过调控植物体内的特异响应miRNAs来控制宿主的免疫响应，实现侵染。
总之，本研究在离体条件下通过整合响应长柄链格孢菌侵染的特异基因和miRNAs信息，同时，结合miRNAs及靶向信息的功能验证初步阐明了长柄链格孢菌侵染叶片过程中，植物体内的抗逆响应机制和调控机制。此外，解析出本氏烟草和长柄链格孢菌侵染互作过程中，长柄链格孢菌通过促发本氏烟草体内关键miRNAs信息来间接控制植物免疫响应这一关键分子事件。本研究所获取的结果为进一步深入阐述和揭示烟草赤星病的侵染机制提供了重要的基础数据信息，同时，也为从分子水平上开发出烟草赤星病抑制方法和优异的抗性资源筛选提供了重要的的参考信息。