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甘蔗（Saccharum spp.hybrids.），禾本科，甘蔗属，是一种重要的糖料作物和潜在的能源作物，对促进我国经济发展和缓解能源危机有着重要作用。二点螟（Chilo infuscatellus），鳞翅目，螟蛾科，是一种具有一年多代和世代重叠特点的蛀茎性害虫，严重危害甘蔗产量。目前，防治二点螟采取“以化学杀虫剂为主，其余防治方法为辅”的综合防治策略，化学杀虫剂的大量长期使用会导致食品安全、环境污染和害虫抗药性形成等问题的出现。转基因技术作为一种新型技术被用于害虫防治研究，受到科学家青睐。但是由于抗性基因存在抗虫谱窄、低表达和易形成抗药性等问题。因此，筛选绿色安全且可持续的抗性基因则显得格外重要。本研究，首先通过小RNA测序获得二点螟miRNA的序列特征和表达情况，再结合转录组数据，预测miRNA靶标；通过生物信息学软件筛选蜕皮激素代谢途径中miRNAs及其靶标基因，再结合TA克隆及3’RACE技术获得蜕皮激素代谢通路中相关基因完整ORF和3’UTR；然后，采用荧光定量PCR和体外双萤光素酶报告实验验证其靶标关系，并通过二点螟miRNA类似物注射实验来揭示miRNA在二点螟变态发育中的功能；最后，利用筛选出的miRNA作为抗性基因创制出抗二点螟的转基因miRNA甘蔗，并利用PCR、Southern blot、qPCR进行抗虫转基因甘蔗的筛选。本次研究结果如下：
1、对二点螟小RNA测序原始数据进行统计分析得到761226条有效的unique数据，进一步与miRBase数据库比对分析可得284条miRNAs，并使用miRanda和TargetScan完成了284个miRNAs的靶标基因预测。通过KEGG Pathway富集分析可知，有2组miRNAs及其靶标基因参与了蜕皮激素代谢的调控作用。Ci-miR-1的靶标基因为Ci-Phm；Ci-miR-2、Ci-miR-3、Ci-miR-4、Ci-miR-5、Ci-miR-6、Ci-miR-7、Ci-miR-8和Ci-miR-9的靶标基因为Ci-CYP18A1。
2、利用TA克隆和3’RACE技术克隆出Ci-CYP18A1和Ci-Phm的完整的ORF和3’UTR。由双荧光素酶检测实验可知：Ci-miR-1使得荧光素表达下降了7.7%，Ci-miR-2至Ci-miR-9分别使得荧光素表达下降了28.03%、55.38%、75.43%、77.53%、63.03%、20.86%、61.12%、28.20%。上述结果表明：Ci-miR-1对Ci-Phm表达没有调控作用，而Ci-miR-2至Ci-miR-9对Ci-CYP18A1表达有不同程度的抑制作用并且Ci-miR-4和Ci-miR-5抑制作用最强。qPCR表明：Ci-miR-1与Ci-Phm的整体表达趋势不相关，Ci-miR-4与Ci-CYP18A1在5龄、6龄、蛹期期间的表达趋势呈负相关，Ci-miR-5与靶基因Ci-CYP18A1在4龄、5龄、6龄期间的表达趋势呈负相关，二点螟幼虫在六龄时，Ci-miR-4和Ci-miR-5表达量均降至最低。
3、miRNA类似物干扰实验表明：在注射Agomir-4和Agomir-5后，miRNAs（Ci-miR-4和Ci-miR-5）在二点螟体内均出现过量表达，这使得Ci-CYP18A1表达受到抑制，最终导致二点螟的死亡率显著增大和化蛹率明显变小。
4、首先合成骨架序列为Osa-pre-miR-528的pre-miR-4和pre-miR-5序列，然后利用In-Fusion技术构建出植物表达载体Ubi-miR-4和Ubi-miR-5，最终通过基因枪和植物组织培养技术获得了转基因miRNA甘蔗。PCR检测表明R4的阳性转基因甘蔗有1株，R5阳性转基因甘蔗有12株。Southern blot结果表明转基因甘蔗R4-1、R5-1、R5-2、R5-3、R5-4、R5-6、R5-12的拷贝数均为2。qPCR结果表明miRNA-4和miRNA-5能够在其转基因植株中表达。
1、对二点螟小RNA测序原始数据进行统计分析得到761226条有效的unique数据，进一步与miRBase数据库比对分析可得284条miRNAs，并使用miRanda和TargetScan完成了284个miRNAs的靶标基因预测。通过KEGG Pathway富集分析可知，有2组miRNAs及其靶标基因参与了蜕皮激素代谢的调控作用。Ci-miR-1的靶标基因为Ci-Phm；Ci-miR-2、Ci-miR-3、Ci-miR-4、Ci-miR-5、Ci-miR-6、Ci-miR-7、Ci-miR-8和Ci-miR-9的靶标基因为Ci-CYP18A1。
2、利用TA克隆和3’RACE技术克隆出Ci-CYP18A1和Ci-Phm的完整的ORF和3’UTR。由双荧光素酶检测实验可知：Ci-miR-1使得荧光素表达下降了7.7%，Ci-miR-2至Ci-miR-9分别使得荧光素表达下降了28.03%、55.38%、75.43%、77.53%、63.03%、20.86%、61.12%、28.20%。上述结果表明：Ci-miR-1对Ci-Phm表达没有调控作用，而Ci-miR-2至Ci-miR-9对Ci-CYP18A1表达有不同程度的抑制作用并且Ci-miR-4和Ci-miR-5抑制作用最强。qPCR表明：Ci-miR-1与Ci-Phm的整体表达趋势不相关，Ci-miR-4与Ci-CYP18A1在5龄、6龄、蛹期期间的表达趋势呈负相关，Ci-miR-5与靶基因Ci-CYP18A1在4龄、5龄、6龄期间的表达趋势呈负相关，二点螟幼虫在六龄时，Ci-miR-4和Ci-miR-5表达量均降至最低。
3、miRNA类似物干扰实验表明：在注射Agomir-4和Agomir-5后，miRNAs（Ci-miR-4和Ci-miR-5）在二点螟体内均出现过量表达，这使得Ci-CYP18A1表达受到抑制，最终导致二点螟的死亡率显著增大和化蛹率明显变小。
4、首先合成骨架序列为Osa-pre-miR-528的pre-miR-4和pre-miR-5序列，然后利用In-Fusion技术构建出植物表达载体Ubi-miR-4和Ubi-miR-5，最终通过基因枪和植物组织培养技术获得了转基因miRNA甘蔗。PCR检测表明R4的阳性转基因甘蔗有1株，R5阳性转基因甘蔗有12株。Southern blot结果表明转基因甘蔗R4-1、R5-1、R5-2、R5-3、R5-4、R5-6、R5-12的拷贝数均为2。qPCR结果表明miRNA-4和miRNA-5能够在其转基因植株中表达。