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南京地区肺炎链球菌分子流行病学调查及耐青霉素肺炎链球菌快速诊断方法初步探讨肺炎链球菌是儿童和成人社区获得性肺炎的最重要病原菌，同时也是引起中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎的主要病原菌。长期以来，青霉素等β-内酰胺类抗生素是治疗肺炎链球菌感染的首选抗生素，而大环内酯类抗生素是社区获得性肺炎的一线用药。但近年来，肺炎链球菌对青霉素、大环内酯类抗生素的耐药率逐年增多，亚洲地区耐药情况尤为严重，引起了临床的广泛关注。
肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制主要是通过青霉素结合蛋白(PBP)的改变而产生，一种或多种PBP逐步突变，改变了细胞壁上相应高分子质量青霉素结合蛋白结构，与青霉素的亲和力降低和/或结合抗生素分子的数量减少，产生不同程度的耐药。与肺炎链球菌耐药性关系密切的PBP基因有pbp1A、2B和2X，其中pbp2B和pbp2X的改变同细菌低水平青霉素耐药有关，同时也是pbp1A改变导致高水平耐药的基础。
肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要有:核糖体靶位改变和主动外排系统。核糖体靶位改变由erm(B)基因介导，可引起大环内酯类抗生素高水平耐药(MIC≥64μg/ml)，且与林可酰胺类和链阳菌素B药物交叉耐药(MLSB型)。主动外排系统由mef(A)基因介导，导致中低水平耐药(MIC=1～32μg/ml)，耐药表型为M型。
由于目前肺炎链球菌耐药形势严峻，本地区缺乏大型分子流行病学调查，本研究探讨了南京地区肺炎链球菌对常用抗生素的敏感性，对β-内酰胺类、大环内酯类抗生素的耐药性、耐药机制以及主要传播机制，并将PCR法应用于肺炎链球菌青霉素敏感性的快速检测。
第一部分、三种PCR方法在耐青霉素肺炎链球菌快速诊断中的应用
一直以来，青霉素都是作为肺炎链球菌感染的首选抗生素之一，然而目前国内青霉素不敏感肺炎链球菌的比例呈逐年上升趋势，而传统药敏检测方法如K-B纸片扩散法、琼脂稀释法、肉汤稀释法等均需耗费较长的时间，因此，对于肺炎链球菌耐药株的严重感染如菌血症、脑膜炎等，急需更快速、可靠的药敏诊断方法以指导早期合理用药。本研究中应用三种不同的方法:PCR、半巢式PCR、PCR-RFLP来诊断青霉素敏感性，以寻求最佳检测手段。2005年3月到2007年6月，从南京地区7家大医院共收集了130株肺炎链球菌临床分离株和50株健康定殖株。其中，健康定殖株均对青霉素敏感，临床分离株青霉素敏感率、中介率、耐药率分别为25.4％，23.1％和51.5％，儿童组耐药率为65.6％而成人组耐药率为11.8％。半巢式PCR检测pbp1A是三种方法中最理想的，可以很好地区分敏感、中介、耐药株，96.1％的PCR结果与MIC相符合，诊断MIC=0.25～0.5μg/ml的菌株时，其敏感性、特异性、阳性预计值、阴性预计值分别为86.7％、98.6％、86.7％、98.6％，在诊断MIC≥1μg/ml的菌株时，其敏感性、特异性、阳性预计值、阴性预计值分别为96.2％，97.6％，97.4％，96.4％。PCR法虽然敏感但不能有效区分中介株和耐药株，PCR-RFLP敏感性不够，仅可用于检测敏感株，但可以作为分子流行病学分析技术。
第二部分、南京地区肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药及传播机制研究
近年来，耐青霉素肺炎链球菌逐年增多，亚洲地区尤为严重。本研究探讨了南京地区肺炎链球菌临床分离株对β-内酰胺类抗生素的耐药性及耐药机制，了解其主要突变类型及耐药传播方式。2005年3月到2007年6月，从南京地区7家大医院共收集了130株肺炎链球菌临床分离株，检测其对青霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、阿莫西林、红霉素、阿奇霉素、左旋氧氟沙星、莫西沙星、美罗培南、万古霉素、替加环素、利奈唑胺等14种常见抗生素的敏感性，对β-内酰胺类高耐株中耐药相关基因pbp1A、pbp2B、pbp2X、murM进行扩增、测序分析，用RFLP和BOX-PCR方法进行分子生物学分型，了解传播方式。本地区肺炎链球菌青霉素不敏感率为74.6％，其中23.1％中介，51.5％耐药。头孢呋辛、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、阿莫西林、美罗培南的耐药率分别为69.2％、17.7％、12.3％、3.1％、6.2％、16.9％，儿童耐药率较成人高。青霉素与其它β-内酰胺类抗生素的MIC水平呈正相关。在阿莫西林耐药株中，pbp基因的有义突变主要围绕在三个保守区域附近，pbp2B的突变在阿莫西林高耐中起重要作用，murM无明显突变，主要表现为murMA等位基因。有5株分子分型为A1-B1-X1-BOX(B)型的多药耐药株可能为克隆传播。
第三部分、南京地区耐大环内酯类抗生素肺炎链球菌分子流行病学调查及相关因素分析
本研究的目的是探讨南京地区肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药率及耐药相关危险因素，分析本地区大环内酯类耐药株的耐药表型、基因型及主要传播机制。K-B纸片扩散法和琼脂稀释法检测130株临床分离株对青霉素、红霉素、克林霉素、阿齐霉素、四环素、替加环素、左氧氟沙星、利奈唑胺、庆大霉素、阿米卡星和氯霉素的敏感性，双纸片扩散法检测耐药表型，PCR法检测耐药基因及转座子相关基因erm(B)、mef(A/E)、tet(M)、intTn、xis、mel，测序分析erm(B)上游控序列，BOX-PCR进行分子分型。结果显示，肺炎链球菌临床分离株对红霉素、克林霉素、阿齐霉素、四环素、阿米卡星和青霉素的耐药率分别为92.3％、89.2％、90.8％、93.8％、91.5％、51.5％，且红霉素、克林霉素、阿齐霉素、四环素的耐药水平均很高。红霉素耐药与其它抗生素耐药有明显相关性。本地区红霉素耐药的相关危险因素主要有:儿童、分离自非侵入性标本、之前使用过大环内酯类药物，青霉素不敏感。在120株红霉素耐药株中，95.8％为cMLSB型，3.3％为 iMLSB型，仅0.8％表现为M型。47.5％仅含有erm(B)耐药基因，2.5％为mef(A/E)阳性，50％同时含有mef(A/E)和erm(B)，所有的mef基因经鉴定均为mef(E)。92.3％的erm(B)基因是由转座子Tn1545携带的，而4.3％由Tn917携带。四环素耐药基因tet(M)，切割酶基因xis和整合酶基因intTn与Tn1545有显著相关性。BOX分子分型结果显示，在本地区Tn917主要为水平传播，而Tn1545既有水平传播又有克隆传播。
总结：南京地区肺炎链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类抗生素的耐药率高于国内其它城市，高耐株主要来源于儿童，且存在小范围耐药株克隆传播。Β-内酰胺类耐药主要与pbp1A、pbp2B、pbp2X的累积突变有关，其中，pbp2B在阿莫西林高耐中起重要作用。大环内酯类抗生素耐药的主要耐药表型、耐药基因型、转座子分别为cMLSB、erm(B)、Tn1545，在本地区Tn917主要为水平传播，而Tn1545既有水平传播又有克隆传播。本地区肺炎链球菌的高耐药率需引起高度关注，因此有必要对肺炎链球菌分子流行病学进行持续监测以阻止高耐药株的进一步传播。