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1.大肠杆菌YeaD的表达、纯化、结晶及其结构分析
Leloir pathway是体内半乳糖代谢的主要途径，这个途径通过三个步骤将乳糖被β-半乳糖苷酶分解产生的β-半乳糖转变成葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸又可通过葡萄糖磷酸变构酶转变成葡萄糖-6-磷酸，从而进入糖酵解途径。半乳糖变旋酶是Leloir pathway途径的第一个酶，它的功能就是把β-半乳糖转变成α-半乳糖，而后者才能通过Leloir pathway最终转变成葡萄糖-1-磷酸。大肠杆菌YeaD是半乳糖变旋酶超家族的成员，虽然该家族成员的催化活性中心相同，但底物结合口袋存在差异，YeaD的结构解析及其结构与功能关系分析将为揭示YeaD的作用机制提供重要的结构基础。
我们通过PCR的方法从大肠杆菌的基因组中获得了目的蛋白基因，并且把它构建到PET22B质粒中。重组蛋白被转化到Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达，目的蛋白通过Ni亲和柱和分子筛的纯化后可达到95％以上的纯度。在经脱盐和浓缩后进行晶体生长。采用悬滴气相扩散法在287K下进行晶体生长实验，最终获得了1.9A分辨率的晶体，并收集了晶体衍射数据。衍射数据经HKL-2000处理得到如下结果：晶体空间群P212121，晶胞参数为a=64.72?，b=97.32?，c=106.99?，一个晶体学不对称单位含2个分子，利用分子置换获得了晶体的初步相位，结构解析工作正在进行中。
2.D-核酮糖-5-磷酸-3-异构酶的表达，纯化以及初步晶体学研究
磷酸戊糖途径是体内葡萄糖代谢的一条支路，分为氧化和非氧化两个部分，非氧化部分的功能是在核酮糖-5-磷酸的基础上通过一系列基团转移反应，将核糖转变成果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸而进入糖酵解途径。D一核酮糖-5-磷酸-3-异构酶(RPE)的功能是通过转变碳骨架的立体化学构象来实现D-核酮糖-5-磷酸和D-木酮糖-5-磷酸之间的互变，而D-核酮糖-5-磷酸和D-木酮糖-5-磷酸的互变是细胞内的戊糖磷酸途径中非氧化途径的第一步反应，
我们从人脑的cDNA文库中克隆了RPE蛋白的基因，并在大肠杆菌表达并纯化了人源RPE蛋白。在纯化人源RPE蛋白过程中，我们意外发现它无法像其它同源重组蛋白那样通过Ni亲和柱来纯化，因为它遇到Ni离子会立刻变成沉淀，这个现象也同时发生在含有Zn离子和Mg离子的情况，但是这些沉淀可以用EDTA重悬，重悬的蛋白经过离子交换柱纯化后可以获得稳定的蛋白同二聚体。为了进一步确认这个现象和重组蛋白上所带的HIStag之间的关系，我们构建了一组质粒，分别为N端带HIStag，C端带HIStag，两端都带HIStag和不带HIStag四种，结果发现N端无HIStag的重组蛋白在大肠杆菌的表达系统里都形成了包涵体，只有N端带有HIStag的才能在表达后获得可溶蛋白。纯化的RPE蛋白采用悬滴气相扩散法在287K下生长7天获得晶体，晶体脱水后通过X-ray衍射获得了分辨率2.3?的晶体结构。晶体衍射数据用HKL2000处理得到如下结果：空间群是P21，晶胞参数：a=64.18?，b=130.78?，c=66.00?，β=113.40°，一个不对称单位含4个分子。利用分子置换获得了晶体的初步相位，结构解析工作正在进行中。蛋白中结合的金属原子利用原子吸收光谱进行了定量检测。