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番木瓜(Carica papaya L.)采后容易成熟软化和品质劣变.1-MCP (1-Methylcyclopropene，1-甲基环丙烯)处理和低温贮藏可显著延缓番木瓜果实软化和成熟.但是,1-MCP使用方法(浓度和时间)不当或贮藏温度过低可导致果实后熟障碍(不能正常软化或转黄),严重影响番木瓜的食用品质和商业价值.
本文研究了 1-MCP 处理和低温胁迫对番木瓜果实后熟品质及细胞壁代谢等生理生化指标的影响,系统分析了1-MCP和低温胁迫条件下,番木瓜后熟期间的乙烯信号转导基因的表达规律;以乙烯信号转导关键基因CpEBF1为诱饵蛋白筛选酵母双杂交cDNA文库,鉴定与后熟障碍密切相关的互作蛋白,并使用双分子荧光互补(BiFC)和GST-pull down技术验证了它们与CpEBF1的互作关系;采用瞬时表达方法分析互作对果实细胞壁降解酶基因的调控作用.主要研究结果如下:
1. 不适当的1-MCP 处理导致果实"橡皮化"后熟障碍并影响软化相关的生理生化变化.
不适当1-MCP处理(400 nL·L-11-MCP处理16 h)导致果实后熟障碍,主要表现为果皮虽能正常转黄,但果肉经催熟后仍不能正常软化,出现"皮黄肉不软"的"橡皮化"后熟障碍;而适当的1-MCP处理(400 nL·L-11-MCP处理1 h)能延缓果实软化成熟但没有后熟障碍.后熟障碍的果实细胞壁结构不能正常降解,木质素和纤维素含量显著高于正常成熟的果实,细胞壁软化相关基因CpPG1/2、CpEXP1/2和CpPMEs的表达受到显著抑制.
2. CpEBF1与CpMADS1/3互作调控1-MCP引起的番木瓜后熟障碍.
不适当的1-MCP 处理显著抑制 CpEBF1的表达,而正常成熟的果实 CpEBF1基因在成熟启动时高度表达.以 CpEBF1 为诱饵,在后熟障碍样本的酵母双杂交cDNA文库中筛选到互作蛋白CpMADS1/3和CpEIL1;采用酵母双杂交(Y2H)、BiFC和GST-pull down技术验证了它们之间的互作关系.亚细胞定位显示它们都定位于细胞核.瞬时表达结果表明CpEBF1与CpMADS1/3互作通过激活CpPG1/2和CpEXP1/2启动子活性调控果实软化.
3. 低温胁迫引起果实后熟障碍并影响相关的生理生化变化.
番木瓜在7℃贮藏25 d发生冷害(Chilling injury，CI),果实转移到室温催熟,表现出明显的冷害症状和不能正常软化转黄的后熟障碍.低温胁迫导致果实细胞壁变薄和着色变浅,细胞核膜、原生质膜受损伤甚至解体,叶绿体结构消失,并增加了细胞壁木质素的含量,促进了木质素合成酶活性升高和基因表达增加.
低温胁迫(7℃)加剧细胞膜损伤,破坏了膜结构的稳定性和完整性,造成膜脂代谢异常,果实丙二醛(MDA 含量和细胞膜透性明显增加,脂氧合酶(LOX)活性显著提高,硬脂酸(C18∶0)、棕榈酸(C16∶0)等饱和脂肪酸的相对含量增加,降低了不饱和脂肪酸亚麻酸(C18∶3)和亚油酸(C18∶2)的相对含量,并且引起果实活性氧和内源激素代谢平衡失调.
4. CpEBF1与CpJAZ3互作调控低温胁迫引起的番木瓜后熟障碍.
低温胁迫诱导果实CpEBF1较强表达,但果实转移到室温催熟后,CpEBF1的表达被显著抑制.以CpEBF1为诱饵蛋白,对酵母双杂交cDNA文库(使用低温胁迫后熟障碍样本)进行互作蛋白筛选,发现了互作蛋白CpJAZ3,采用BiFC、GST-pull down方法证实了它们的互作关系.并且CpJAZ3基因在整个低温胁迫被显著地诱导表达.另外,采用Y2H、BiFC和GST-pull down方法,发现CpJAZ3与CpERF9也存在互作.低温胁迫显著诱导CpERF9表达,但果实转移至室温后熟表达显著下降.瞬时表达分析结果表明,CpJAZ3与CpEBF1、CpERF9互作抑制了细胞壁降解基因CpPG2和CpPME1启动子活性,影响软化基因转录从而调控果实软化成熟.
5. CpEBF1和互作蛋白在1-MCP和低温胁迫引起的番木瓜后熟障碍调控网络的构建.
不适宜的1-MCP 处理显著抑制乙烯生成和乙烯信号转导途径中大部分基因的表达,显著降低了乙烯和乙烯响应对果实软化成熟的影响,而且几乎完全抑制了CpEBF1和CpMADS1/3的表达,降低了它们互作对果实软化基因的激活作用,是导致番木瓜成熟障碍的重要原因.
低温胁迫使CpEBF1基因降低了对乙烯的敏感性,抑制了乙烯信号,影响果实正常成熟.低温胁迫抑制茉莉酸(JA)产生,诱导CpJAZ3基因表达,促进了CpJAZ3与CpEBF1、CpERF9互作对细胞壁降解基因的抑制作用,是导致番木瓜成熟障碍的重要原因.
本文研究了 1-MCP 处理和低温胁迫对番木瓜果实后熟品质及细胞壁代谢等生理生化指标的影响,系统分析了1-MCP和低温胁迫条件下,番木瓜后熟期间的乙烯信号转导基因的表达规律;以乙烯信号转导关键基因CpEBF1为诱饵蛋白筛选酵母双杂交cDNA文库,鉴定与后熟障碍密切相关的互作蛋白,并使用双分子荧光互补(BiFC)和GST-pull down技术验证了它们与CpEBF1的互作关系;采用瞬时表达方法分析互作对果实细胞壁降解酶基因的调控作用.主要研究结果如下:
1. 不适当的1-MCP 处理导致果实"橡皮化"后熟障碍并影响软化相关的生理生化变化.
不适当1-MCP处理(400 nL·L-11-MCP处理16 h)导致果实后熟障碍,主要表现为果皮虽能正常转黄,但果肉经催熟后仍不能正常软化,出现"皮黄肉不软"的"橡皮化"后熟障碍;而适当的1-MCP处理(400 nL·L-11-MCP处理1 h)能延缓果实软化成熟但没有后熟障碍.后熟障碍的果实细胞壁结构不能正常降解,木质素和纤维素含量显著高于正常成熟的果实,细胞壁软化相关基因CpPG1/2、CpEXP1/2和CpPMEs的表达受到显著抑制.
2. CpEBF1与CpMADS1/3互作调控1-MCP引起的番木瓜后熟障碍.
不适当的1-MCP 处理显著抑制 CpEBF1的表达,而正常成熟的果实 CpEBF1基因在成熟启动时高度表达.以 CpEBF1 为诱饵,在后熟障碍样本的酵母双杂交cDNA文库中筛选到互作蛋白CpMADS1/3和CpEIL1;采用酵母双杂交(Y2H)、BiFC和GST-pull down技术验证了它们之间的互作关系.亚细胞定位显示它们都定位于细胞核.瞬时表达结果表明CpEBF1与CpMADS1/3互作通过激活CpPG1/2和CpEXP1/2启动子活性调控果实软化.
3. 低温胁迫引起果实后熟障碍并影响相关的生理生化变化.
番木瓜在7℃贮藏25 d发生冷害(Chilling injury，CI),果实转移到室温催熟,表现出明显的冷害症状和不能正常软化转黄的后熟障碍.低温胁迫导致果实细胞壁变薄和着色变浅,细胞核膜、原生质膜受损伤甚至解体,叶绿体结构消失,并增加了细胞壁木质素的含量,促进了木质素合成酶活性升高和基因表达增加.
低温胁迫(7℃)加剧细胞膜损伤,破坏了膜结构的稳定性和完整性,造成膜脂代谢异常,果实丙二醛(MDA 含量和细胞膜透性明显增加,脂氧合酶(LOX)活性显著提高,硬脂酸(C18∶0)、棕榈酸(C16∶0)等饱和脂肪酸的相对含量增加,降低了不饱和脂肪酸亚麻酸(C18∶3)和亚油酸(C18∶2)的相对含量,并且引起果实活性氧和内源激素代谢平衡失调.
4. CpEBF1与CpJAZ3互作调控低温胁迫引起的番木瓜后熟障碍.
低温胁迫诱导果实CpEBF1较强表达,但果实转移到室温催熟后,CpEBF1的表达被显著抑制.以CpEBF1为诱饵蛋白,对酵母双杂交cDNA文库(使用低温胁迫后熟障碍样本)进行互作蛋白筛选,发现了互作蛋白CpJAZ3,采用BiFC、GST-pull down方法证实了它们的互作关系.并且CpJAZ3基因在整个低温胁迫被显著地诱导表达.另外,采用Y2H、BiFC和GST-pull down方法,发现CpJAZ3与CpERF9也存在互作.低温胁迫显著诱导CpERF9表达,但果实转移至室温后熟表达显著下降.瞬时表达分析结果表明,CpJAZ3与CpEBF1、CpERF9互作抑制了细胞壁降解基因CpPG2和CpPME1启动子活性,影响软化基因转录从而调控果实软化成熟.
5. CpEBF1和互作蛋白在1-MCP和低温胁迫引起的番木瓜后熟障碍调控网络的构建.
不适宜的1-MCP 处理显著抑制乙烯生成和乙烯信号转导途径中大部分基因的表达,显著降低了乙烯和乙烯响应对果实软化成熟的影响,而且几乎完全抑制了CpEBF1和CpMADS1/3的表达,降低了它们互作对果实软化基因的激活作用,是导致番木瓜成熟障碍的重要原因.
低温胁迫使CpEBF1基因降低了对乙烯的敏感性,抑制了乙烯信号,影响果实正常成熟.低温胁迫抑制茉莉酸(JA)产生,诱导CpJAZ3基因表达,促进了CpJAZ3与CpEBF1、CpERF9互作对细胞壁降解基因的抑制作用,是导致番木瓜成熟障碍的重要原因.