论文部分内容阅读
2008年，本课题组从云南盐矿中分离得到一株命名为Thermobifidahalotolerans YIM90462T的耐盐嗜热双歧菌。2011年本实验室的张峰博士从该菌株中克隆获得一个第9家族的纤维素内切酶(ThCel9A)，并在E.coli BL21(DE3)中对其进行了异源表达。从结构域上看，ThCel9A与同属的一株放线菌Thermobifidafusca YX中的Cel9A相比，仅多一个Ⅲ型纤连蛋白结构域(Fn3)，也就是含有两个Ⅲ型纤连蛋白结构域。然而，目前关于Fn3结构域在纤维素内切酶中的功能，还不清楚。 基于本实验室前期对Thermobifida halotolerans YIM90462T中ThCel9A的研究，本研究以纤维素内切酶(ThCel9A)为研究材料，通过各种分子生物学手段和酶学检测试验，对纤维素内切酶ThCel9A中两个Ⅲ型纤连蛋白结构域功能进行研究。运用PCR一步法对ThCel9A中两个Fn3进行敲除，获得ThCel9A-△Fn31,2，发现其纤维素内切酶活性力降低了约40％;若将Fn31,2替换为其它片段，与ThCel9A-△Fn31,2相比酶活力部分恢复，但仍低于ThCel9A。定点突变结果也表明，对Fn31,2结构域保守位点突变后，ThCel9A酶活力有明显变化。说明Fn31,2在ThCel9A中所扮演的功能，并非只是简单的连接作用。 基于此，本研究提出以下三种假设:第一，Fn31,2在ThCel9A仅起到简单连接两个结构域的功能;第二，Fn31,2作为结合结构域，起到类似纤维素结合结构域的作用;第三，Fn31,2可能有其它未知的功能。 通过在大肠杆菌中克隆表达Fn31,2，对纯化蛋白进行Binding试验。非变性亲和电泳结果表明Fn31,2对β-葡聚糖，羧甲基纤维素钠(CMC)，木聚糖，纤维二糖均无明显的Binding作用。然而，有趣的是，在对Fn31,2酶活性进行测定时，发现它具有纤维素内切酶活性。据我们了解，这是首次关于Fn31,2具有纤维素内切酶活性的报道。进一步研究显示，Fn31,2的许多酶学特性（如:最适pH、最适温度、降解产物等）都与ThCel9A相似。这可能是其与ThCel9A在相同的选择压力下发生趋同进化的结果。 本研究对于我们全面了解Fn31,2结构域在纤维素酶中的功能及纤维素酶分子的改造有重要指导意义。但关于Fn31,2是如何获得纤维素内切酶活性的还需从分子进化和蛋白晶体结构方面进一步研究。