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本研究分为二部分：
第一部分 NOS与AT1的阻断对大鼠心肌缺血损伤的作用及VEGF表达的影响
目的：
心肌缺血是冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病的病理生理学基础。通过研究心肌缺血的病理生理及其变化机制,探讨药物性预处理保护缺血心肌的作用,为缺血性心脏病治疗提出了新的研究思路和研究领域。心肌缺血时,心肌局部肾素血管紧张素系统(RAS)激活,血管紧张素II(AngiotensinII,AngII)通过与其受体结合,影响着梗死心肌的恢复[3,4]。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)具有扩血管活性作用,是心肌细胞重要的信号转导分子,它在缺血心肌中究竟是升高还是降低,对缺血心肌的作用是保护还是损伤,多年来一直存在争议[1,2],没有定论。NO与AngII之间平衡失调是心肌缺血的重要发病机制,RAS系统是增加还是降低NO的生成存在争议,没有定论。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前所知的最重要的促血管新生的因子[5],能有效的改善心肌缺血,促进梗死心肌的恢复[6]。研究发现NO、Ang II、VEGF三者的信号转导通路方面有诸多交叉,几乎都可以通过Ras途径、plc、影响PKC,最终对核转录因子的影响产生相互制约[3],但是三者的相互调节关系以及三者的关系对缺血心肌的作用仍不清楚。本研究旨在探讨NO与AngII的调节对大鼠心肌缺血损伤的作用及对VEGF表达的影响。
方法：
将30只SD大鼠随机分成5组(每组均为6只):A：对照组(COL)、B：异丙肾上腺素组(ISO)、C：异丙肾上腺素+氯沙坦组(LOS)、D：异丙肾上腺素+硝基左旋精氨酸组(L-NNA)、E：异丙肾上腺素+氯沙坦+硝基左旋精氨酸组(LOS+L-NNA)。由异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导大鼠急性心肌缺血模型；选用NOS(Nitric Oxide Synthase,NOS)的阻断剂硝基左旋精氨酸(N-nitro-L-arginene,L-NNA),及AngII选择性受体AT1的阻断剂氯沙坦(Losartan,Los)对ISO诱导的急性心肌缺血大鼠进行预处理,BL-420F生物信号处理系统监测心功能指标,生物化学方法检测心肌NO、血液肌酸激酶(Creatine Kinade,CK),HE染色观察心肌组织损伤情况,免疫组织化学染色分析VEGF及eNOS的蛋白表达,RT-PCR半定量检测VEGF、eNOS在心肌中mRNA表达。
结果：
1.与单独使用L-NNA和LOS+L-NNA-起使用相比,LOS明显改善了ISO诱导的心功能损伤,其LVSP、±dP/dt max、Vmax均显著升高(P<0.01),LVEDP显著降低(P<0.01)。
2.HE染色及CK检测结果显示:LOS明显改善了ISO诱导的心肌细胞损伤,其CK的漏出量与单独使用L-NNA和LOS+L-NNA-起使用相比显著降低(P<0.01)。
3.NO检测结果：心肌缺血时,NO含量降低,LOS显著提高了大鼠缺血心肌的NO含量(P<0.01),与L-NNA一起使用或单独使用L-NNA均不能提高大鼠缺血心肌的NO含量。
4.免疫组织化学染色结果显示VEGF在LOS组大鼠心肌表达增加,与其它各组的表达相比差异具有显著统计学意义(P<0.01):eNOS在LOS组及LOS+L-NNA组的表达均增加,与其它组相比差异具有显著统计学意义(全部P<0.01)。
5.RT-PCR结果显示VEGFmRNA在LOS组大鼠心肌表达增加,与其它各组的表达相比差异具有统计学意义(P<0.01):eNOS mRNA在LOS组及LOS+L-NNA组的表达均增加,与其它组相比差异也具有统计学意义。
结论：
心肌缺血时,心肌NO含量降低,AT1受体阻断剂Losartan可以通过促进心肌eNOS表达增加NO生成,Losartan可部分通过对eNOS/NO的调节促进VEGF的表达,达到保护缺血心肌的作用。
第二部分 NOS与AT1阻断对心肌细胞的作用及VEGF表达的影响
目的：
探讨NO与AngII的调节对过氧化氢(H2O2)损伤的心肌细胞的作用及VEGF表达的影响。
方法：
原代培养SD新生大鼠心肌细胞,用H2O2建立心肌细胞损伤模型,用LOS(10、102、103umol/l)、L-NNA(102、103、104umol/l)、LOS10umol/l+L-NNA102umol/l处理后,观察对受损心肌细胞的影响。生物化学方法检测心肌细胞NO;台盼蓝染色观察心肌细胞存活率,Heochst33342染色检测心肌细胞凋亡指数；免疫组化染色分析心肌细胞VEGF及eNOS的蛋白表达,RT-PCR检测VEGFmRNA、eNOSmRNA在心肌细胞中的表达。
结果：
1.LOS各组心肌细胞存活率较H2O2组、L-NNA各组及LOS+L-NNA组均显著增高(P<0.01),而心肌细胞凋亡指数较其显著降低(P<0.01)。
2.NO检测结果：心肌细胞受损时,NO含量降低,LOS显著提高了受损心肌细胞的NO含量,与H2O2组、L-NNA各组及L-NNA+LOS组相比具有显著统计学意义(P<0.01),LOS与L-NNA-起使用或单独使用L-NNA均不能提高受损心肌细胞的NO含量。
3.免疫组织化学染色结果显示：
(1)VEGF表达:VEGF在LOS各组心肌细胞表达增加。LOS10umol/l组与控制组、DMSO、生理盐水组的表达相比差异有显著统计学意义(P<0.01),与L-NNA各组、L-NNA+LOS组、H2O2组相比差异有统计学意义(P<0.05),LOS102umol/l组和LOS103umol/l组与除LOS10umol/l组外的其它相比差异均具有显著统计学意义(全部P<0.01)。
(2)eNOS表达:eNOS在LOS各组及LOS+L-NNA组的表达均增加。LOS10umol/l组控制组、DMSO、生理盐水组的表达相比差异有显著统计学意义(P<0.01),与L-NNA各组、H2O2组相比差异有统计学意义(P<0.05);LOS102umol/l组和LOS103umol/l组与除LOS10umol/l组及L-NNA+LOS组外的其它相比差异均具有显著统计学意义(全部P<0.01);L-NNA+LOS组与除LOS各组外的其他组相比差异有显著统计学意义(全部P<0.01)。
4.RT-PCR结果显示
(1)VEGFmRNA表达:VEGFmRNA在LOS各组心肌细胞表达增加。LOS10umol/l组与控制组、DMSO、生理盐水组的表达相比差异有显著统计学意义(P<0.01),与L-NNA各组、L-NNA+LOS组、H2O2组相比差异有统计学意义(P<0.05),LOS102umol/l组和LOS103umol/l组与除LOS10umol/l组外的其它相比差异均具有显著统计学意义(全部P<0.01)。
(2)eNOS mRNA表达:eNOSmRNA在LOS各组及LOS+L-NNA组的表达均增加。LOS10umol/l组与控制组、DMSO、生理盐水组的表达相比差异有显著统计学意义(P<0.01),与L-NNA各组、H2O2组相比差异有统计学意义(P<0.05);LOS102umol/l组和LOS103umol/l组与除LOS10umol/l组及L-NNA+LOS组外的其它相比差异均具有显著统计学意义(全部P<0.01);L-NNA+LOS组与除LOS各组外的其他组相比差异有显著统计学意义(全部P<0.01)。
结论：
心肌细胞受损时,NO含量降低,AT1受体阻断剂Losartan可以通过促进心肌细胞eNOS的表达增加NO生成,Losartan可部分通过对eNOS/NO的调节促进VEGF的表达,起到保护心肌细胞的作用。