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目的:
①观察Bmp2/4 dKO、Bmp2 cKO和Bmp4 cKO小鼠软骨内成骨情况,比较BMP2和BMP4在软骨细胞成熟过程中的生理功能;
②观察Bmp2/4 dKO小鼠半月板部分切除联合前交叉韧带离断后膝关节的病理改变,探讨BMP2/4是否介导了骨关节炎的病理过程;
③研究黄芪甲苷对体外诱导的软骨细胞肥大分化的抑制作用及作用机理。
方法：
①将Bmp2fx/fx/Bmp4fx/fx,Bmp2fx/fx和Bmp2fx/fx小鼠分别与Col2a1-CreERT2;Bmp2fx/fxBmp4fx/fx,Col2a1-CreERT2;Bmp2fx/fx和Col2a1-CreERT2;Bmp4fx/fx小鼠交配,于E12.5时给孕鼠腹腔注射Tomaxifen,分别于E14.5和E18.5时,处死孕鼠,取出胚胎,基因型鉴定后,进行全骨架染色、组织形态学染色、免疫组织化学染色、原位杂交及实时荧光定量RT-PCR分析。
②取8w龄Col2a1-CreERT2,BMP2fx/fxBMP4fx/fx与同窝BMP2fx/fx/BMP4fx/fx小鼠,腹腔注射Tomaxifen,每天1次,连续注射5d。8w和16w后分别取左膝关节进行Micro-CT扫描三维重建和组织形态学观察;4w后于小鼠左膝关节行内侧半月板部分切除及前交叉韧带离断术,术后8w取双侧膝关节,分别进行Micro-CT扫描三维重建,组织形态学染色和免疫组织化学染色,观察膝关节病理改变。
③用IL-1β处理RCS细胞,采用real-time RT-PCR观察Col2a1、ColX mRNA表达水平的变化,以及BMP2和BMP4 mRNA的表达;采用BMP2处理RCS细胞,检测Col2a1、ColX mRNA表达水平;在IL-1β和BMP2处理的基础上,分别加入黄芪甲苷,观察黄芪甲苷对IL-1β和BMP2诱导的软骨细胞肥大分化的影响;在黄芪甲苷预处理的基础上,分别加入IL-1β和BMP2刺激,采用Western Blot法检测下游ERKl/2、JNK、p38和Smad1/5的磷酸化水平;将12xSBE报告基因转染至RCS细胞并以黄芪甲苷进行干预,检测报告基因活性。
结果：
①全骨架染色显示E18.5时,Bmp2/4 dKO和Bmp2 cKO胚胎明显小于同窝对照胚胎。Bmp2/4 dKO和Bmp2 cKO胚胎的软骨终板中,组织形态学染色显示胫骨软骨内成骨受到抑制,增殖层和肥大层软骨细胞形态异常,软骨细胞肥大分化延迟。而Bmp4 cKO胚胎与同窝对照相比,在形态学上差异微小。PCNA染色显示Bmp2/4 dKO和Bmp2 cKO胚胎的软骨终板的软骨细胞增殖受到抑制;TUNEL染色显示软骨细胞凋亡增加;原位杂交显示Bmp2/4 dKO和Bmp2 cKO胚胎的软骨终板中Col2a1、ColX及Mmp13的表达明显受到抑制,实时荧光定量RT-PCR显示Col2a1、aggrecan及Sox9 mRNA表达显著下降。
②膝关节三维重建和阿尔辛兰/橙黄G染色显示,16w和24w时,Bmp2/4 dKO小鼠膝关节未出现明显关节软骨退变改变,与同窝Cre-negative小鼠相比无显著差异。行内侧半月板部分切除联合前交叉韧带离断术后8w,膝关节三维重建显示,Cre-negative小鼠膝关节内侧半月板钙化增加,Bmp2/4 dKO小鼠膝关节三维重建未见明显半月板钙化增加。臧红/快绿染色显示Cre-negative小鼠膝关节内侧半月板钙化,关节软骨退变,边缘骨赘形成,而Bmp2/4 dKO小鼠膝关节软骨表面不平整,臧红染色不均,部分失染,但未出现明显骨赘形成。免疫组化显示Cre-negative小鼠关节表面软骨Ⅱ型胶原染色降低甚至大片消失,X型胶原表达从关节软骨深层移至表层,而Bmp2/4 dKO小鼠关节软骨表面仅出现Ⅱ型胶原染色降低,有部分X型胶原表达。
③IL-1β处理RCS细胞24h后即可以引起ColX mRNA水平的显著升高,并且可以诱导BMP2 mRNA,而非BMP4 mRNA的表达,BMP2同样也可以显著诱导软骨细胞表达Runx2和ColX mRNA;黄芪甲苷可以一定程度上抑制IL-1β和BMP2引起的Runx2和ColX mRNA表达上升,黄芪甲苷对IL-1β下游ERK1/2、JNK、p38的磷酸化以及BMP2 mRNA表达上升没有显著抑制作用,但是可以部分抑制BMP2下游Smad1/5的磷酸化以及BMP2对12xSBE报告基因的激活。
结论：
①Bmp2/4 dKO和Bmp2 cKO胚胎的软骨细胞增殖和肥大分化障碍,导致软骨内成骨异常,而Bmp4 cKO胚胎软骨内成骨过程则接近正常。BMP2对于软骨细胞的发育具有不可或缺的生理作用。
②Bmp2/4敲除可以减轻半月板部分切除联合前交叉韧带离断诱导的小鼠膝关节软骨退变。BMP信号参与介导了骨关节炎的病理过程。
③IL-1β可以在体外诱导软骨细胞肥大分化,该作用可能部分是通过BMP2实现的。黄芪甲苷可以减轻IL-1β诱导的软骨细胞肥大分化,其作用与抑制BMP信号下传,进而抑制BMP/Smad信号通路活性有关。