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目的: 了解OPG基因敲除小鼠骨质疏松的发生情况,研究密骨灵及其拆方和活性成分防治该小鼠骨质疏松症的作用机制。
方法:
1.OPG基因敲除纯合子(OPG-/-)小鼠的繁殖、表型鉴定及动态观察。OPG-/-小鼠进行非频密法繁殖,抽取4周龄子代及亲代鼠尾的DNA,通过PCR扩增后,进行电泳,根据电泳条代对小鼠的基因表现型进行鉴定,同时观察子代发育情况,对小鼠骨架进行动态染色观察,双能X线骨密度测量仪(dual energey X-ray absorprion,DEXA)、化学比色法分别测定12周龄、16周龄与24周龄子代小鼠全身骨密度(Bone mineral density,BMD)、血浆碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。
2.OPG-/-小鼠和同龄野生型(OPG+/+)小鼠的比较。16周龄OPG-/-小鼠和同龄OPG+/+小鼠各10只(雌雄各半),DEXA测定全身BMD、万能材料试验机测定股骨三点弯曲生物力学指标；骨组织形态计量学分析L5椎体骨小梁结构；Real-timePCR检测L1椎体骨组织中BMP-2、Runx2mRNA表达水平。
3.C57BL/6J小鼠的动态观察。12、20和24周龄C57BL/6J小鼠各10只(雌雄各半),DEXA检测全身BMD、体重、脂肪含量,化学比色法检测血浆ALP活性,Real-time PCR检测L1椎体骨组织中BMP-2 mRNA表达水平,万能材料试验机检测股骨三点弯曲生物力学指标；Partial过程对BMD与体重、脂肪含量进行偏相关性分析。
4.密骨灵活性成分防治OPG基因敲除小鼠骨质疏松症的有效剂量筛选。12周龄OPG-/-纯合子小鼠50只,随机分为空白对照组、密盖息组、蛇床子素高剂量(15mg/kg/d)组、蛇床子素中剂量(10mg/kg/d)组、蛇床子素低剂量(5mg/kg/d)组,每组10只(雌雄各半)。皮下给药1月后,DEXA测定全身BMD、万能材料试验机测定股骨三点弯曲生物力学指标；骨组织形态计量学分析L5椎体骨小梁结构；Real-time PCR检测L1椎体骨组织中BMP-2、Runx2mRNA表达水平。
5.密骨灵及其拆方和活性成分防治骨质疏松症的作用机制研究。12周龄OPG-/-小鼠90只,随机分为空白对照组、固邦组、密骨灵组、密骨灵益气化瘀类中药拆方组、益气补肾类中药拆方组、化瘀补肾类中药拆方组、淫羊藿苷组、补骨脂素组、蛇床子素组,每组10只(雌雄各半),含药饲料给药3个月后,DEXA测定全身BMD、体重、脂肪含量,万能材料试验机检测股骨三点弯曲生物力学指标,化学比色法检测血浆ALP活性,ELISA检测血浆骨钙素(bone Gla protein,BGP)水平,Micro-CT重建椎体三维结构。
结果:
1.OPG-/-小鼠子代同亲代小鼠一样,均表现为OPG基因缺失,电泳中出现同样620bp条带；OPG-/-小鼠骨架发育正常。从12周到24周,全身BMD、血浆ALP活性逐渐下降,16周龄、24周龄与12周龄比较有显著差异(P<0.05)。
2.与同龄OPG+/+小鼠比较,16周龄OPG-/-小鼠全身BMD、股骨承受最大载荷、股骨结构刚度、腰椎椎体Tb.N、腰椎椎体Tb.Th显著下降(P<0.01);股骨承受破裂载荷、腰椎椎体Tb.Ar(％)下降(P<0.05);股骨承受载荷后的最大位移、破裂位移显著增加(P<0.01);腰椎椎体Tb.Sp增加(P<0.05),腰椎椎体Runx2mRNA表达升高(P<0.05);腰椎椎体中BMP-2 mRNA表达升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。
3.从12周到24周,C57BL/6J小鼠体重逐渐增加(P<0.01);脂肪含量呈增加趋势,20周及24周较12周明显增加(P<0.01);全身BMD呈增加趋势,24周较12周明显增加(P<0.05);血将ALP活性呈下降趋势,20周、24周较12周明显下降(P<0.01-0.05),L1椎体中BMP-2 mRNA表达呈下降趋势,20周及24周较12周明显下降(P<0.01);股骨承受的最大载荷呈增加趋势,24周较12周明显增加(P<0.01);股骨承受载荷时最大位移呈下降趋势,20周、24周较12周下降明显(P<0.05);股骨结构刚度呈上升趋势,但差异没有统计学意义(P>0.05);BMD与体重、脂肪含量的偏相关系数分别为0.7035、0.6231(P<0.01)。
4.蛇床子素3个剂量组OPG-/-小鼠股骨承受载荷后发生的最大位移及破裂位移显著减少(P<0.05);5mg/kg/d剂量腰椎椎体Tb.N以及腰椎椎体BMP-2、Runx-2mRNA的表达显著增加(P<0.05),全身BMD、股骨承受的最大载荷、破裂载荷、腰椎椎体Tb.Ar(％)、Tb.Th有增加趋势,腰椎椎体Tb.Sp有减少趋势；10mg/kg/d剂量腰椎椎体Runx2mRNA的表达亦显著增加(P<0.05),全身BMD、腰椎椎体Tb.Ar(％)、Tb.N、Tb.Th、BMP-2mRNA表达有增加趋势,股骨承受最大载荷、破裂载荷有减少趋势,腰椎椎体Tb.Sp有增加趋势；15mg/kg/d剂量全身BMD、股骨承受的最大载荷及破裂载荷、腰椎椎体Tb.Ar(％)、Tb.N、Runx2mRNA表达有增加趋势,腰椎椎体BMP-2mRNA、Tb.Th、Tb.Sp有下降趋势。
5.密骨灵及其拆方和活性成分组OPG-/-小鼠体重、脂肪含量、脂肪比、全身BMD、股骨的结构刚度、股骨的破裂载荷及承受载荷时释放的能量增加；密骨灵及其益气补肾类中药拆方和活性成分淫羊藿苷、补骨脂素组股骨承受的最大载荷增加(P<0.05);密骨灵及其拆方和活性成分蛇床子素组血浆ALP活性、BGP水平升高,淫羊藿苷、补骨脂素组血浆ALP活性、BGP水平降低(P<0.05);密骨灵及其益气补肾类中药拆方组腰椎椎体BVF、Tb.N、Tb.Th增加,Tb.Sp减少：蛇床子素组腰椎椎体BVF、Tb.Th增加(P<0.05),Tb.Sp减少；化瘀补肾类中药拆方、淫羊藿苷、补骨脂素组腰椎椎体BVF、Tb.N、Tb.Th减少,Tb.Sp增加。
结论:
1.OPG-/-小鼠是一种理想的骨质疏松模式动物。
2.密骨灵及其拆方和活性成分均可以提高OPG-/-小鼠骨质量、增强骨强度。其中密骨灵、密骨灵拆方、活性成分蛇床子素主要是通过升高血浆ALP活性、BGP水平,促进成骨发挥治疗骨质疏松症的作用,而密骨灵活性成分淫羊藿苷、补骨脂素是通过降低血浆ALP活性、BGP水平,降低骨转换率、抑制破骨达到治疗骨质疏松症的作用。密骨灵、密骨灵益气补肾类中药拆方、活性成分蛇床子素在在提高骨质量、增强骨强度的同时,明显改善OPG-/-小鼠腰椎椎体结构；
3.在密骨灵及其拆方和活性成分中,以密骨灵防治骨质疏松症的作用最强；拆方中以益气补肾类中药拆方作用最强；活性成分中以蛇床子素作用最强。
4.密骨灵及其拆方和活性成分在提高骨质量、改善骨强度的同时,增加体重、脂肪含量,体现出中医药防治骨质疏松症的整体作用。