论文部分内容阅读
植物的生长发育和响应干旱、抵御干旱的机制涉及到表观遗传调节作用，组蛋白乙酰化是一种重要的表观遗传调控，植物体内组蛋白乙酰化与去乙酰化过程处于动态平衡，由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)共同调控，影响细胞分化、生长发育以及对生物和非生物胁迫等内外信号应答的一系列生物学进程。表观遗传调控对花生胁迫响应的研究未见报道。实验室在前期分析花生响应干旱的RNA-seq数据时，发现一个RPD3/HDA1-like亚家族的组蛋白去乙酰酶，在PEG模拟干旱、外源ABA处理下表达显著上调，该基因命名为AhHDA1(Arachis hygogaea histone deacetylase1)。本论文从花生中克隆AhHDA1，研究其原核表达蛋白的酶活性，在花生器官及在响应水分胁迫早期过程中AhHDA1转录水平的表达以及与植株响应干旱的关系。主要研究结果如下: 1.从粤油7号花生中克隆得到AhHDA1基因，生物信息学分析，AhHDA1全长1401bp，编码的蛋白质具有467个氨基酸，分子质量为52.37KDa，等电点为5.28。AhHDA1与拟南芥AtHDA6蛋白的同源性为77.12％，含有高度保守的组蛋白去乙酰化酶活性区域。 2，采用qPCR方法分析AhHDA1在花生器官的的表达，结果发现AhHDA1在胚根，胚芽，胚轴，根、茎、叶，以及开花期的花中均有表达，其中在胚根和根中表达较高。 3，外施ABA处理花生幼苗，AhHDA1的转录水平逐渐升高，并在5h达到最大值;AhAREB1，AhDREB2A-like，AhWRKY33-like，AhNCED1和AhDHN2均在处理1h后转录水平增加到最大值。 4，PEG条件下，花生体内AhHDA1的转录水平在处理1h先降低，后逐渐升高，并在5h达到最大值;受ABA诱导的基因如AhDREB2A-like，AhNCED1，AhDHN2在处理1h后表达量开始增加，2h达到最大值，AhAREB1，AhWRKY33-like分别在处理1h和2h后表达量下降，但随后表达量急剧升高，在5h达到最大值。 5，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA（Trichostatin A）处理四叶期花生，AhHDA1转录水平的表达明显上调，且5h达到最高;AhAREB1，AhDREB2A-like,AhWRKY33-like，AhDHN2和AhNCED1在处理1h后表达量急剧增加，其中AhAREB1，AhDREB2A-like，AhNCED1，AhDHN2在1h表达量达到最高值;AhWRKY33-like在2-8h表达先降低后升高，在8h达到最高值。结果表明AhHDA1的表达模式与ABA信号通路和相关抗旱基因类似。 6，纯化pPROEXHTa—AhHDA1融合蛋白，确定其具有组蛋白去乙酰化酶活性。在此基础上，制备了AhHDA1多克隆抗体。在拟南芥原生质体中瞬时表达pCanG-AhHDA1融合蛋白，发现AhHDA1能定位在细胞核;将AhHDA1转化拟南芥野生型Col、基因缺失突变体hda6，经过分子鉴定并筛选获得p35S∷AhHDA1/Col，p35S∷AhHDA1/hda6异源表达纯合植株各3个株系。 7，p35S∷HDA1/Col，p35S∷HDA1/hda6幼苗在干旱处理下叶片相对含水量和干旱存活率均低于野生型和hda6突变体，气孔开度略有提高，表明异源表达AhHDA1拟南芥植株抗旱性降低。采用qPCR方法检测异源表达AhHDA1幼苗干旱处理后相关抗旱基因RNA水平的表达，其中:hda6突变体AtABF3，AtNCED3的表达较野生型Col显著提高，p35S∷HDA1/Col与Col变化不显著，p35S∷HDA1/hda6的表达仍高于Col，但较hda6突变体降低。hda6突变体在干旱处理后，体内RD29A表达较野生型Col显著降低。p35S∷HDA1/Col的表达量较Col略有降低;而p35S∷HDA1/hda6的表达量高于hda6。 综上所述，从花生中克隆的AhHDA1基因编码的蛋白具有组蛋白去乙酰化酶活性，PEG模拟干旱、外源ABA和HDAC抑制剂TSA处理，诱导花生叶片AhHDA1及AhAREB1、AhDREB2A、AhWRKY33、AhDHN、AhNCED1的表达;拟南芥hda6突变体的抗旱性较野生型Col强，在Col中异源表达AhHDA1抗旱能力略有下降但不显著，在hda6中异源表达AhHDA1可部分回复HDA6的功能;说明拟南芥HDA6基因与AhHDA1高度同源，在hda6突变体中异源表达AhHDA1确实可以与HDA6基因功能互补。组蛋白去乙酰化影响植物对非生物胁迫的响应过程可能主要依赖于ABA信号通路。