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目的
结肠癌是第三大常见的恶性肿瘤，其发病率排名第三，仅次于乳腺癌、肺癌，由于后期较容易转移至淋巴结以及远端器官，预后较差，复发率高，其死亡率排名第二，仅次于肺癌。近年来结肠癌患者治疗的手段主要包括手术、放疗、化疗及靶向治疗。由于早期结肠癌诊断的方法有限以及后期结肠癌容易发生转移和肿瘤复发，晚期转移患者的五年生存期仅为12％，因此迫切需要寻找一个结肠癌预测的潜在分子标记物及治疗靶点，为探索结肠癌发病的机制提供分子基础和方向。
人类婆罗双树样基因4(spalt-like transcription factor 4，SALL4)是近年来新发现的一种癌胚基因，是维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能的锌指蛋白转录因子。SALL4基因的表达随发育成熟的过程逐渐下调，在完全分化的细胞以及大多数正常的成体组织中表达下调或缺失。然而越来越多的研究表明，SALL4在多种肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、生殖细胞瘤、子宫内膜癌、胶质瘤、肾母细胞瘤以及白血病等)中异常高表达，且SALL4的表达水平与肿瘤发展进程、患者生存期以及不良预后等具有一定的相关性，使其逐渐成为肿瘤预测的生物学标记物。SALL4基因异常激活的特异性表达模式以及在肿瘤发生发展中的作用使其成为多种肿瘤治疗的潜在靶点。越来越多的研究主要集中于SALL4结构、表达、生物学功能以及SALL4与肿瘤发生发展的关系，然而关于SALL4与结肠癌的关系尚未完全阐明，尤其SALL4在结肠癌中的表达水平及在结肠癌发生发展中发挥的作用仍不清晰。本研究初步观察了SALL4在结肠癌中的表达水平，并基于RNAi技术初步探究了SALL4对结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及肿瘤干性等肿瘤生物学行为的影响，旨在为结肠癌寻找一个肿瘤预测的潜在分子标记物及治疗靶点，为后续进一步深入研究SALL4调控结肠癌发生发展的分子机制提供一定的依据。
方法
1.通过Oncomine、UALCAN数据库分析SALL4在正常结肠组织及结肠癌组织中的表达情况。
2.通过免疫组化进一步验证人结肠癌组织及配对的癌旁组织SALL4的表达。
3.通过qRT-PCR和Westernblot技术检测人结肠癌细胞系SALL4的表达。
4.化学合成3种针对SALL4靶基因的siRNA，分别转染高表达SALL4的结肠癌细胞，通过qRT-PCR和Western-blot验证siRNA-SALL4对结肠癌细胞中SALL4表达的沉默效率。
5.通过克隆形成和CCK8实验检测SALL4对结肠癌细胞增殖活性的影响。
6.通过流式细胞仪和Western-blot检测SALL4对结肠癌细胞凋亡的影响。
7.通过Transwell小室实验检测SALL4对结肠癌细胞侵袭能力的影响。
8.通过细胞划痕实验、Transwell小室及Western-blot实验检测SALL4对结肠癌细胞迁移能力的影响。
9.通过Western-blot检测结肠癌细胞中EMT相关标志物:E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白及波形蛋白的表达情况。
10.通过qRT-PCR检测结肠癌细胞中肿瘤干性相关标记物:Oct4，Sox2，CD44及Bim-1的mRNA表达
结果
1.Oncomine和UALCAN数据库分析显示，SALL4在结肠癌组织的表达明显高于其正常组织，且SALL4的表达水平与结肠癌患者生存期呈负相关的关系。
2.免疫组化方法显示，结肠癌组织SALL4的表达明显高于癌旁组织。
3.基因和蛋白结果显示，与HCT116，LOVO，HT29细胞相比，SW480细胞表达水平最高，因此我们选择SW480细胞用于后续功能实验。
4.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，转染siRNA-SALL4后，实验组siRNA-SALL4-1在结肠癌细胞中SALL4的表达水平明显较低。我们选择siRNA-SALL4-1序列用于后续的功能实验。
5.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后，结肠癌细胞的细胞克隆数量明显减少，且细胞增殖活性明显降低。
6.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)的细胞凋亡率相比，下调SALL4表达后，结肠癌细胞晚期凋亡的比例明显增加，促凋亡蛋白Bax的表达明显增加，抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2的表达明显下调。
7.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后穿膜的细胞数明显降低。
8.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后结肠癌细胞的划痕宽度愈合速度较慢，迁移的细胞数量明显降低。
9.蛋白结果显示下调SALL4表达后E-cadherin蛋白的表达增加，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表达降低。
10.与空白对照(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后结肠癌细胞中Oct4和CD44的mRNA表达下调。
结论
1.我们初步观察到SALL4在结肠癌中高表达且在SW480细胞中表达相对较高。随后我们基于RNAi技术化学合成的三种针对SALL4靶基因的siRNA(siRNA-SALL4-1、siRNA-SALL4-2和siRNA-SALL4-3)，分别转染高表达SALL4的结肠癌细胞SW480，成功筛选出干扰SALL4表达最佳的siRNA-SALL4-1序列。
2.通过体外多种实验证实下调SALL4表达可抑制结肠癌细胞的增殖、促进凋亡，并通过抑制EMT过程削弱结肠癌细胞的迁移侵袭能力，提示SALL4的高表达可能促进结肠癌的发生发展，该研究结果为后续进一步深入研究SALL4调控结肠癌发生发展的分子机制提供了一定的依据。
结肠癌是第三大常见的恶性肿瘤，其发病率排名第三，仅次于乳腺癌、肺癌，由于后期较容易转移至淋巴结以及远端器官，预后较差，复发率高，其死亡率排名第二，仅次于肺癌。近年来结肠癌患者治疗的手段主要包括手术、放疗、化疗及靶向治疗。由于早期结肠癌诊断的方法有限以及后期结肠癌容易发生转移和肿瘤复发，晚期转移患者的五年生存期仅为12％，因此迫切需要寻找一个结肠癌预测的潜在分子标记物及治疗靶点，为探索结肠癌发病的机制提供分子基础和方向。
人类婆罗双树样基因4(spalt-like transcription factor 4，SALL4)是近年来新发现的一种癌胚基因，是维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能的锌指蛋白转录因子。SALL4基因的表达随发育成熟的过程逐渐下调，在完全分化的细胞以及大多数正常的成体组织中表达下调或缺失。然而越来越多的研究表明，SALL4在多种肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、生殖细胞瘤、子宫内膜癌、胶质瘤、肾母细胞瘤以及白血病等)中异常高表达，且SALL4的表达水平与肿瘤发展进程、患者生存期以及不良预后等具有一定的相关性，使其逐渐成为肿瘤预测的生物学标记物。SALL4基因异常激活的特异性表达模式以及在肿瘤发生发展中的作用使其成为多种肿瘤治疗的潜在靶点。越来越多的研究主要集中于SALL4结构、表达、生物学功能以及SALL4与肿瘤发生发展的关系，然而关于SALL4与结肠癌的关系尚未完全阐明，尤其SALL4在结肠癌中的表达水平及在结肠癌发生发展中发挥的作用仍不清晰。本研究初步观察了SALL4在结肠癌中的表达水平，并基于RNAi技术初步探究了SALL4对结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及肿瘤干性等肿瘤生物学行为的影响，旨在为结肠癌寻找一个肿瘤预测的潜在分子标记物及治疗靶点，为后续进一步深入研究SALL4调控结肠癌发生发展的分子机制提供一定的依据。
方法
1.通过Oncomine、UALCAN数据库分析SALL4在正常结肠组织及结肠癌组织中的表达情况。
2.通过免疫组化进一步验证人结肠癌组织及配对的癌旁组织SALL4的表达。
3.通过qRT-PCR和Westernblot技术检测人结肠癌细胞系SALL4的表达。
4.化学合成3种针对SALL4靶基因的siRNA，分别转染高表达SALL4的结肠癌细胞，通过qRT-PCR和Western-blot验证siRNA-SALL4对结肠癌细胞中SALL4表达的沉默效率。
5.通过克隆形成和CCK8实验检测SALL4对结肠癌细胞增殖活性的影响。
6.通过流式细胞仪和Western-blot检测SALL4对结肠癌细胞凋亡的影响。
7.通过Transwell小室实验检测SALL4对结肠癌细胞侵袭能力的影响。
8.通过细胞划痕实验、Transwell小室及Western-blot实验检测SALL4对结肠癌细胞迁移能力的影响。
9.通过Western-blot检测结肠癌细胞中EMT相关标志物:E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白及波形蛋白的表达情况。
10.通过qRT-PCR检测结肠癌细胞中肿瘤干性相关标记物:Oct4，Sox2，CD44及Bim-1的mRNA表达
结果
1.Oncomine和UALCAN数据库分析显示，SALL4在结肠癌组织的表达明显高于其正常组织，且SALL4的表达水平与结肠癌患者生存期呈负相关的关系。
2.免疫组化方法显示，结肠癌组织SALL4的表达明显高于癌旁组织。
3.基因和蛋白结果显示，与HCT116，LOVO，HT29细胞相比，SW480细胞表达水平最高，因此我们选择SW480细胞用于后续功能实验。
4.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，转染siRNA-SALL4后，实验组siRNA-SALL4-1在结肠癌细胞中SALL4的表达水平明显较低。我们选择siRNA-SALL4-1序列用于后续的功能实验。
5.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后，结肠癌细胞的细胞克隆数量明显减少，且细胞增殖活性明显降低。
6.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)的细胞凋亡率相比，下调SALL4表达后，结肠癌细胞晚期凋亡的比例明显增加，促凋亡蛋白Bax的表达明显增加，抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2的表达明显下调。
7.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后穿膜的细胞数明显降低。
8.与空白对照组(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后结肠癌细胞的划痕宽度愈合速度较慢，迁移的细胞数量明显降低。
9.蛋白结果显示下调SALL4表达后E-cadherin蛋白的表达增加，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表达降低。
10.与空白对照(Ctrl组)及阴性对照组(NC组)相比，下调SALL4表达后结肠癌细胞中Oct4和CD44的mRNA表达下调。
结论
1.我们初步观察到SALL4在结肠癌中高表达且在SW480细胞中表达相对较高。随后我们基于RNAi技术化学合成的三种针对SALL4靶基因的siRNA(siRNA-SALL4-1、siRNA-SALL4-2和siRNA-SALL4-3)，分别转染高表达SALL4的结肠癌细胞SW480，成功筛选出干扰SALL4表达最佳的siRNA-SALL4-1序列。
2.通过体外多种实验证实下调SALL4表达可抑制结肠癌细胞的增殖、促进凋亡，并通过抑制EMT过程削弱结肠癌细胞的迁移侵袭能力，提示SALL4的高表达可能促进结肠癌的发生发展，该研究结果为后续进一步深入研究SALL4调控结肠癌发生发展的分子机制提供了一定的依据。