基因工程抗肿瘤药物重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基中试纯化工艺、临床前药理及机理研究

来源 :北京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chao_huang
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研究发现重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(recombinanthumancalcineurinBsubunit,rhCNB)具有抑制肿瘤生长的潜能,本实验室构建了rhCNB的高效表达工程菌。为满足中试开发的需要,作者制备了较大体积的层析柱,对rhCNB的纯化工艺进行放大。对三批50L发酵罐发酵产品进行纯化,结果证明实验室建立的rhCNB的纯化工艺可以对rhCNB进行放大纯化,可以得到纯度、活性和药效均合格的终产品,同时作者改进纯化过程中的相关操作,所得终产品中内毒素含量合格。 另外,作为基因工程药物开发的需要,作者又进行了rhCNB的安全性评价。结果证明该产品急性毒性极低,在拟采取的最佳剂量(5mg/0.2ml/kg鼠重)的208倍时小鼠都没有死亡;同时用拟采取的最佳剂量的rhCNB连续对小鼠进行注射时,发现rhCNB对小鼠的体重、脾指数、肝指数都没有明显的影响,而抗肿瘤药物环磷酰胺的连续注射却使小鼠体重下降非常明显。这也从侧面说明rhCNB对小鼠的安全性较好。 为了探讨rhCNB的抗肿瘤机理,作者检测了rhCNB对小鼠免疫功能的影响。结果发现在rhCNB每天连续注射的过程中,小鼠外周血白细胞和阴性对照组相比呈先升高后趋于稳定:另外rhCNB可以提高小鼠腹腔细胞的数量和贴壁能力,增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力;同时发现rhCNB连续注射6天后,小鼠外周血淋巴细胞中CD3+T和CD4+T细胞所占比例有所升高。这些结果说明rhCNB能提高机体的免疫功能,这可能是其抑制肿瘤生长的原因之一。 为了进一步研究rhCNB的抗瘤机理以及CNB在体内的独立的功能,作者构建了人CNB的真核转染质粒pEGFP-Cl/CNB和pCDNA3.1/CNB。转染真核细胞后,获得了CNB过表达的稳定细胞株。在对CNB过表达细胞株的生物学行为进行研究时发现,CNB过表达的细胞增殖能力、非锚着依赖生长的能力,迁移能力都增强,同时对血清依赖生长的能力降低。这说明CNB过表达促使细胞恶化。同时对细胞内的磷酸酶活性分析显示,钙调蛋白磷酸酶(calcineurin,CN)的活性没有明显的改变,这说明这些生物学行为的改变是CNB的单独的功能。随后作者又用双向电泳比较了CNB过表达细胞和对照细胞蛋白表达谱的差异,并用质谱法对差异蛋白进行了鉴定,结果发现两个和肿瘤相关的蛋白热休克蛋白(HSP27)、DJ-1在CNB过表达细胞中高表达。用PROPRED服务器对CNB的一级序列和MHCⅡ分子的结合潜能进行分析,结果表明CNB可以和51个MHCⅡ等位基因中的49个(96%)结合。推测注射到小鼠体内的rhCNB可能可以被MHCⅡ分子递呈给CD4+T细胞,而活化的CD4+T细胞可能在活化小鼠非特异免疫功能以及抑制肿瘤生长中可能发挥着重要的作用。这为进一步研究rhCNB的抗瘤机理,开发抑瘤效果更高的片断以及探索更佳的治疗方式奠定了基础。
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