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背景
大多数缺血性卒中患者遗留神经功能缺陷，针对神经再生与修复的治疗仍是当前的难点问题。干细胞移植是当前神经再生领域的研究热点，其发挥作用的机制并非简单地替代缺失细胞，而是通过旁分泌途径发挥旁观者效应（bystandereffect），调节组织微环境从而诱导宿主神经修复潜能。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs）释放的外泌体（exosomes）通过携带miRNAs介导了细胞通讯，参与调节了脑组织的损伤后修复。川芎-当归是缺血性中风临床常用药对，芎归方以川芎、当归组方，具有活血化瘀、养血通络之功。团队前期开展了以芎归方开发上市的中成药舒脑欣滴丸（SNX）治疗缺血性中风的临床和机制研究，证实SNX具有促进tMCAO模型大鼠神经功能恢复、促进内源性神经细胞增殖等作用，其有效组分川芎嗪(ligustrazine,TMP)、阿魏酸(ferulicacid,FA)配比对缺氧缺糖损伤的PC12细胞具有保护作用。因此，川芎-当归及组分配比是否可通过修饰MSCs增加其促进神经元轴突生长的作用，以及涉及的具体作用机制，值得进一步深入研究。
目的
运用生物信息手段分析川芎-当归药对治疗缺血性中风的靶点网络，研究芎归方（SNX）及有效组分配比（TMP+FA）诱导的骨髓间充质干细胞条件培养液对神经元轴突生长的影响及作用机制。
方法
1、应用网络药理学方法对“川芎-当归”药对的化学成分、作用靶点和卒中疾病进行网络构建，并对核心靶点群进行GO富集和KEGG富集分析。
2、体外培养BMSCs，加入不同浓度SNX（10、5、1、5×10-1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5）mg/ml及TMP+FA配比浓度为（0.5:5、1:10、2:20、4:40）μmol/L，筛选药物安全范围；选择SNX组（5×10-1、1×10-1、25×10-4）mg/ml及TMP+FA配比浓度为（1:10、2:20、4:40）μmol/L，将药物干预BMSCs后的条件培养液（BMSCs-CM）与原代皮质神经元细胞共培养，观察其是否具有促进神经元轴突生长作用。
3、以TMP+FA配比（浓度为2:20μmol/L）干预BMSCs，检测BMSCs-CM中miR17-92簇的表达水平。将转染inhibitorNCmimics，inhibitormiR17-92mimics的BMSCs予TMP+FA(2:20μmol/L)配比干预，将组分配比干预后的BMSCs-CM与PC12细胞共培养，检测PC12细胞PTEN基因、蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达的情况。
结果
1、基于网络药理学川芎—当归药对治疗中风的潜在机制研究发现，一些成分靶标在卒中疾病中发挥重要作用；生物过程主要涉及细胞对神经生长因子刺激的反应、细胞对转化生长因子刺激的反应、生长因子反应、负调控凋亡过程等方面；KEGG通路富集分析，疾病通路涉及核糖体通路、病毒致癌通路、雌激素信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt等信号通路。
2、SNX干预BMSCs，Control组比较，SNX浓度（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4）mg/ml范围内均没有药物毒性，差异无统计学意义(P＞0.05)；与Control组比较，SNX（5×10-1、1×10-5）mg/ml，范围内均没有药物毒性，差异有统计学意义(P＜0.01)。SNX干预的BMSCs-CM与原代皮质神经元共培养，与对照组相比，药物干预BMSCs的条件培养液促进原代神经元的轴突生长，差异具有统计学意义(P＜0.05)，SNX5×10-1mg/ml干预BMSCs的条件培养液与原代皮质神经元共培养轴突长度最佳。不同浓度TMP+FA配比（0.5:5、1:10、2:20、4:40）μmol/L干预BMSCs24h后，与Control组比较，TMP+FA配比（0.5:5、1:10）μmol/L，差异无统计学意义(P＞0.05)；与Control组比较，TMP+FA配比（2:20、4:40）μmol/L，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中TMP+FA配比2:20μmol/L干预BMSCs所得条件培养液促进神经元轴突生长最佳。选取FA+TMP(2:20)μmol/L进行机制研究。
3、通过RT-PCR法检测TMP+FA配比2:20μmol/L干预BMSCs所得条件培养液外泌体中miR17-92簇的变化，与Control组相比，miR17的变化差异无统计学意义(P＞0.05)；miR18a，miR19a，miR19b，miR20a，miR92a均高表达，差异具有统计学意义(P＜0.05)。将inhibitorNCmimics，inhibitormiR17-92mimics转染至BMSCs细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05)。将转染inhibitorNCmimics，inhibitormiR17-92mimics的BMSCs细胞分别予TMP:FA=2:20μmol/L干预，将各组所得条件培养液干预PC12细胞，结果表明，NC-+(TMP+FA)组所得条件培养液干预后，PTENmRNA及蛋白水平方面下降最明显。与对照组相比，NC-+(TMP+FA)组，miR17-92-+(TMP+FA)组PI3K，AKT，mTOR，p-PI3K，p-AKT，p-mTOR蛋白水平变化均上调，其中NC-+(TMP+FA)组蛋白变化水平最明显，说明神经元轴突生长与PI3K/AKT/mTORT通路相关。
结论
1、SNX5×10-1mg/ml干预BMSCs的条件培养液与原代皮质神经元共培养轴突长度最佳；TMP和FA配比2:20μmol/L干预BMSCs所得条件培养液促进神经元轴突生长最佳。中药干预BMSCs可改善其旁分泌功能。
2、通过RT-PCR检测miR17-92、PTENmRNA水平的表达，单体配比可提高条件培养中miR17-92含量，miR17-92可能促进神经元轴突生长，与PTEN负相关。具体机制需进一步研究
3、FA、TMP配比干预BMSCs所得条件培养液可通过PI3K/Akt/mTOR途径发挥促进神经元轴突生长作用。
大多数缺血性卒中患者遗留神经功能缺陷，针对神经再生与修复的治疗仍是当前的难点问题。干细胞移植是当前神经再生领域的研究热点，其发挥作用的机制并非简单地替代缺失细胞，而是通过旁分泌途径发挥旁观者效应（bystandereffect），调节组织微环境从而诱导宿主神经修复潜能。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs）释放的外泌体（exosomes）通过携带miRNAs介导了细胞通讯，参与调节了脑组织的损伤后修复。川芎-当归是缺血性中风临床常用药对，芎归方以川芎、当归组方，具有活血化瘀、养血通络之功。团队前期开展了以芎归方开发上市的中成药舒脑欣滴丸（SNX）治疗缺血性中风的临床和机制研究，证实SNX具有促进tMCAO模型大鼠神经功能恢复、促进内源性神经细胞增殖等作用，其有效组分川芎嗪(ligustrazine,TMP)、阿魏酸(ferulicacid,FA)配比对缺氧缺糖损伤的PC12细胞具有保护作用。因此，川芎-当归及组分配比是否可通过修饰MSCs增加其促进神经元轴突生长的作用，以及涉及的具体作用机制，值得进一步深入研究。
目的
运用生物信息手段分析川芎-当归药对治疗缺血性中风的靶点网络，研究芎归方（SNX）及有效组分配比（TMP+FA）诱导的骨髓间充质干细胞条件培养液对神经元轴突生长的影响及作用机制。
方法
1、应用网络药理学方法对“川芎-当归”药对的化学成分、作用靶点和卒中疾病进行网络构建，并对核心靶点群进行GO富集和KEGG富集分析。
2、体外培养BMSCs，加入不同浓度SNX（10、5、1、5×10-1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5）mg/ml及TMP+FA配比浓度为（0.5:5、1:10、2:20、4:40）μmol/L，筛选药物安全范围；选择SNX组（5×10-1、1×10-1、25×10-4）mg/ml及TMP+FA配比浓度为（1:10、2:20、4:40）μmol/L，将药物干预BMSCs后的条件培养液（BMSCs-CM）与原代皮质神经元细胞共培养，观察其是否具有促进神经元轴突生长作用。
3、以TMP+FA配比（浓度为2:20μmol/L）干预BMSCs，检测BMSCs-CM中miR17-92簇的表达水平。将转染inhibitorNCmimics，inhibitormiR17-92mimics的BMSCs予TMP+FA(2:20μmol/L)配比干预，将组分配比干预后的BMSCs-CM与PC12细胞共培养，检测PC12细胞PTEN基因、蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达的情况。
结果
1、基于网络药理学川芎—当归药对治疗中风的潜在机制研究发现，一些成分靶标在卒中疾病中发挥重要作用；生物过程主要涉及细胞对神经生长因子刺激的反应、细胞对转化生长因子刺激的反应、生长因子反应、负调控凋亡过程等方面；KEGG通路富集分析，疾病通路涉及核糖体通路、病毒致癌通路、雌激素信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt等信号通路。
2、SNX干预BMSCs，Control组比较，SNX浓度（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4）mg/ml范围内均没有药物毒性，差异无统计学意义(P＞0.05)；与Control组比较，SNX（5×10-1、1×10-5）mg/ml，范围内均没有药物毒性，差异有统计学意义(P＜0.01)。SNX干预的BMSCs-CM与原代皮质神经元共培养，与对照组相比，药物干预BMSCs的条件培养液促进原代神经元的轴突生长，差异具有统计学意义(P＜0.05)，SNX5×10-1mg/ml干预BMSCs的条件培养液与原代皮质神经元共培养轴突长度最佳。不同浓度TMP+FA配比（0.5:5、1:10、2:20、4:40）μmol/L干预BMSCs24h后，与Control组比较，TMP+FA配比（0.5:5、1:10）μmol/L，差异无统计学意义(P＞0.05)；与Control组比较，TMP+FA配比（2:20、4:40）μmol/L，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中TMP+FA配比2:20μmol/L干预BMSCs所得条件培养液促进神经元轴突生长最佳。选取FA+TMP(2:20)μmol/L进行机制研究。
3、通过RT-PCR法检测TMP+FA配比2:20μmol/L干预BMSCs所得条件培养液外泌体中miR17-92簇的变化，与Control组相比，miR17的变化差异无统计学意义(P＞0.05)；miR18a，miR19a，miR19b，miR20a，miR92a均高表达，差异具有统计学意义(P＜0.05)。将inhibitorNCmimics，inhibitormiR17-92mimics转染至BMSCs细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05)。将转染inhibitorNCmimics，inhibitormiR17-92mimics的BMSCs细胞分别予TMP:FA=2:20μmol/L干预，将各组所得条件培养液干预PC12细胞，结果表明，NC-+(TMP+FA)组所得条件培养液干预后，PTENmRNA及蛋白水平方面下降最明显。与对照组相比，NC-+(TMP+FA)组，miR17-92-+(TMP+FA)组PI3K，AKT，mTOR，p-PI3K，p-AKT，p-mTOR蛋白水平变化均上调，其中NC-+(TMP+FA)组蛋白变化水平最明显，说明神经元轴突生长与PI3K/AKT/mTORT通路相关。
结论
1、SNX5×10-1mg/ml干预BMSCs的条件培养液与原代皮质神经元共培养轴突长度最佳；TMP和FA配比2:20μmol/L干预BMSCs所得条件培养液促进神经元轴突生长最佳。中药干预BMSCs可改善其旁分泌功能。
2、通过RT-PCR检测miR17-92、PTENmRNA水平的表达，单体配比可提高条件培养中miR17-92含量，miR17-92可能促进神经元轴突生长，与PTEN负相关。具体机制需进一步研究
3、FA、TMP配比干预BMSCs所得条件培养液可通过PI3K/Akt/mTOR途径发挥促进神经元轴突生长作用。