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本论文借助生物信息学的方法,分析了HBV基因组中ATG的分布及其保守性。已有的研究表明其中一些ATG高度保守,对于HBV的正常复制周期具有重要的生物学功能。但是,还有一些保守性极高的ATG,其生物学意义并不清楚。本论文选择研究了SORF中高度保守ATG的相关功能。
分析表明,在HBV基因组的正链上,共有31个由ATG起始的ORF。其中C ORF中存在4个融框的ATG,依次命名为C1-C4; PORF中存在9个融框的ATG,依次命名为P1-P9;SORF中存在9个融框的ATG,依次命名为S1-S9;X ORF中存在3个融框的ATG,依次命名为X1-X3。另外,在PORF中还存在4个非融框的ATG,依次命名为N1-N4;S和X ORF上游各有1个融框的ATG,分别命名为S0和X0。已知C1和C2分别起始pre-core和core蛋白的翻译;P1负责起始翻译聚合酶蛋白;S1、S3和S4分别起始L、M和S蛋白的翻译;X1负责起始翻译X蛋白。但是,对于保守性极高的P2、P5、P7、S5和S8,并不清楚其是否具有重要的生物学功能。
为了研究HBV SORF中高度保守ATG的相关功能,构建了融合不同标签的表面蛋白表达载体。通过超表达系统和Western blot检测,除主带以外,观察到了一些规律分布的较弱条带。分子量计算表明,SORF中高度保守的内部ATG S5、S6和S7可能具有起始密码子功能。对S5、S6进行定点突变,Western blot带型发生改变,进一步说明S5、S6号ATG具有起始密码子的功能。为了在更接近真实的病毒复制环境中,研究S5、S6是否同样具有起始密码子功能,在pHBV1.3的S ORF末端融合了HA标签,并针对S5、S6进行了点突变。Western blot检测,未见S5、S6作为起始密码子的证据。但是,突变S5导致HBsAg分泌障碍,并且这种分泌障碍不能通过提供S5起始翻译的蛋白反式互补,表明S5号ATG对HBsAg的分泌具有重要意义,且这种重要性与S5是否作为起始密码子没有关系。