论文部分内容阅读
研究背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是导致痴呆的最常见原因,它正日益成为全球关注的健康问题,对个人和社会带来巨大的影响。AD的病因尚不明确,通常是由多种遗传、家族和环境因素共同导致,其中年龄、家族史和基因是其主要危险因素。AD是一种进展性疾病,目前尚无根本治愈方法。近年来,干细胞移植作为治疗神经系统退行性疾病的一种新方法受到越来越多的关注。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种良好的移植干细胞,具有可大量获得、通过简单程序直接收获、免疫耐受以及在道德和伦理方面不受限制等优点。目前研究发现,骨髓间充质干细胞具有神经分化功能,较多分化为神经胶质,而分化为神经元的能力有限。神经营养因子在神经系统的正常发育和发挥功能中扮演重要角色。其中神经营养因子3（Neurotrophin-3,NT-3）被越来越多的证据表明可以促进神经元存活和神经修复。研究发现NT-3可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元,移植过表达NT-3的骨髓间充质干细胞可以促进脊髓损伤大鼠模型运动功能的恢复和神经再生。因此,我们推测NT-3基因可以更有效地促进骨髓间充质干细胞的神经元样分化,移植NT-3基因修饰的骨髓间充质干细胞可能对神经再生和认知功能的改善有一定的作用。研究目的:本研究旨在探究NT-3具有促进BMSCs神经元样分化的作用及其可能机制,探讨NT-3修饰BMSCs移植对阿尔茨海默病大鼠认知功能的改善作用,为BMSCs移植治疗阿尔茨海默病提供一定的实验及理论基础。研究方法:本研究由体外实验和体内实验两部分构成:第一部分:体外实验1、Sprague-Dawley（SD）大鼠处死后无菌条件下分离股骨与胫骨骨髓,收集骨髓细胞,传代培养至第三代BMSCs,用CD90、CD44、CD45、CD34抗体经流式细胞仪鉴定BMSCs,分别诱导BMSCs成骨分化、成脂分化,并染色鉴定。2、将合成的大鼠NT-3全长基因克隆至慢病毒表达载体中,用短发夹状RNA（sh-RNA）来沉默NT-3的表达。构建大鼠NT-3过表达慢病毒、sh-NT-3慢病毒,Western Blot检测NT-3表达水平,确定干扰效率最佳的慢病毒。3、慢病毒转染BMSCs,用浓缩病毒和6 μ g/mL聚乙烯在无血清培养基中感染BMSCs进行慢病毒介导的转导。24h后用完全培养液替代培养基,Western blot检测NT-3表达水平。4、取新生SD大鼠,做原代神经元的分离培养、纯化及纯度鉴定。原代神经元与第3代BMSCs共培养8天,经免疫细胞化学实验检测神经元的标志物β Ⅲ-tubulin/β-catenin、NSE、NF-200 的表达情况。5、Western Blot检测细胞全蛋白中β-catenin表达情况以及细胞核中β-catenin表达。荧光定量PCR及免疫荧光检测各组细胞NT-3和β-catenin表达情况。第二部分体内实验1、将寡聚体Aβ 1-42注射到大鼠脑室建立AD大鼠模型,将SD大鼠随机分成四组,包括PBS组、BMSCs组、过表达NT-3的BMSCs组、沉默NT-3的BMSCs组。AD模型建立7天后,将PBS、BMSCs、过表达NT-3的BMSCs、沉默NT-3的BMSCs通过立体定向的方法注射到AD大鼠模型的双侧海马区。1个月后利用Morris水迷宫方法观察并评估其在空间探索试验以及定位航行试验中的行为学改变;利用新事物识别实验来测定大鼠的认知功能。2、BMSCs移植1个月后,检测完行为学后,取大鼠海马组织,通过Western Blot方法检测 NT-3、神经突触素 1（Synapsin-1）、突触素（Synaptophysin,SYP）、突触后密度蛋白-95（PSD95）、全蛋白β-catenin、细胞核蛋白中β-catenin蛋白的表达。3、BMSCs移植1个月后,检测完行为学,取大鼠海马组织,利用免疫组化检测海马区Aβ 1-42的表达,利用免疫荧光方法检测海马区NSE、NF-200表达情况。研究结果:第一部分:体外实验1、流式细胞术检测第3代BMSCs的表面标记物,结果显示细胞表面CD90和CD44呈强阳性,而造血干细胞标记物CD45和CD34表达呈阴性。2、慢病毒成功转染BMSCs,免疫荧光染色NSE、β Ⅲ-tubulin、NF-200阳性。各组细胞转染后细胞活力高,增殖能力强,凋亡率低。3、实时Real-time PCR结果显示过表达NT-3可显著增加BMSCs中β-catenin mRNA表达;Western Blot结果显示共培养BMSCs的总蛋白和细胞核内β-catenin蛋白表达水平均明显升高,沉默NT-3基因均可显著下调它们的表达;免疫荧光染色检测β-catenin的表达,进一步证实过表达NT-3可促进BMSCs中β-catenin表达,沉默NT-3可降低其表达。第二部分:体内实验1、AD大鼠移植BMSCs后,NT-3-BMSCs组大鼠的认知功能与PBS组相比明显好转;sh-NT-3-BMSCs组大鼠的认知功能与NT-3-BMSCs组相比明显变差。2、BMSCs移植1个月后通过Western Blot方法检测海马组织中NT-3蛋白表达,NT-3-BMSCs组大鼠海马组织中NT-3表达与PBS组相比明显增加,而sh-NT-3-BMSCs组NT-3表达与NT-3-BMSCs组相比明显下降。3、免疫组化结果显示:NT-3-BMSCs组Aβ 1-42水平与PBS组相比明显降低;sh-NT-3-BMSCs组A β 1-42水平与NT-3-BMSCs组相比明显升高。4、Western Blot结果显示:NT-3-BMSCs组海马组织NT-3水平较PBS组明显提高,sh-NT-3-BMSCs 组 NT-3 水平与 NT-3-BMSCs 组相比明显降低。NT-3-BMSCs组 Synapsin-1、SYP、PSD95 水平与 PBS 组相比明显升高;sh-NT-3-BMSCs 组Synapsin-1、SYP、PSD95 水平与 NT-3-BMSCs 组相比明显降低。NT-3-BMSCs 组全蛋白和胞核内蛋白β-catenin的水平与PBS组相比明显上升,而sh-NT-3-BMSCs组全蛋白和细胞核内蛋白β-catenin的水平与NT-3-BMSCs组相比明显下降。5、NSE和NF-200的表达通过免疫荧光染色来检测。与PBS组相比,NT-3-BMSCs组NSE和NF-200的表达明显升高。与NT-3-BMSCs组相比,sh-NT-3-BMSCs组NSE和NF-200的表达明显降低。研究结论:1、慢病毒介导NT-3基因可以成功转染BMSCs,BMSCs可以稳定表达NT-3基因。2、NT-3能够成功稳定地促进BMSCs神经元样分化功能。3、NT-3通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的神经元样分化。4、NT-3修饰的BMSCs能够改善痴呆大鼠认知功能。5、NT-3通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的神经元样分化及神经再生,改善痴呆大鼠认知功能。