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研究背景溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种慢性非特异性炎症性疾病（Inflammatory bowel disease,IBD）,多位于乙状结肠、直肠,也可向近端延伸穿过部分或整个结肠,呈连续分布。腹痛、腹泻、黏液脓血便是该疾病的典型症状。研究统计,UC发病率近年来加速上升,全球患病率超过0.3%,严重影响了患者的生活质量,并带来沉重的经济负担。黏膜愈合被认为是一个新的治疗目标,可以降低再住院率、手术和致残率。目前UC治疗不仅费用高昂,而且药物相关不良反应较多,难以达到预期的治疗目标。UC确切发病机制目前尚不完全清楚,多种遗传及环境因素可能导致粘膜免疫系统失调、肠道菌群改变以及肠道屏障受损。肠上皮屏障作为第一道物理和免疫保护墙,用于抵抗毒素和病原体的入侵。肠上皮细胞过度死亡、紧密连接蛋白表达和分布改变均可引起肠上皮屏障损伤,这也是UC病理特征之一。近年来研究报道非编码RNA（Non-coding RNAs,ncRNAs）参与IBD发病的病理生理机制。全基因组关联研究发现包括ncRNAs在内的约240个IBD相关危险位点。NcRNAs是转录和翻译水平上不可或缺的基因调控因子,主要包括长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）、微小非编码RNA（MicroRNA,miRNA）、环状 RNA（Circular RNA,circRNA）等。CircRNAs因其独特的环状结构而更具有稳定性。CircRNAs还具有丰富性、保守性、组织特异性和阶段特异性,因此被认为是潜在的生物标志物。研究表明UC患者circRNAs表达异常,其通过多种方式参与UC炎症过程,如调节细胞因子和趋化因子、肠上皮细胞自噬、肠粘膜屏障损伤等。目前与UC相关的circRNAs报道较少,circRNAs在UC中功能和具体机制有待探索。明确影响肠道上皮屏障的关键circRNAs及其作用机制,对UC预防和治疗具有重大临床意义。本研究分为三个部分,对UC患者肠粘膜活检组织进行全转录组学测序,筛选与UC显著相关的circRNAs;在独立UC患者肠粘膜活检样本中验证筛选circRNA的表达,并对其与UC临床特征进行相关性分析,探讨该circRNA在UC肠上皮屏障中的作用;对circRNA参与调控肠上皮屏障功能可能的分子机制进行探索。第一部分溃疡性结肠炎患者全转录组学特征性改变研究目的:研究表明circRNAs在UC进展中发挥重要作用,以circRNAs为切入点有望为UC提供新的治疗靶点。因此本部分研究对UC患者肠粘膜进行全转录组学测序,应用生物信息学分析相关circRNAs、miRNAs以及mRNAs,筛选特征性circRNAs并进行功能学分析。研究方法:于山东大学齐鲁医院招募年龄20-65岁的UC患者和健康志愿者。对符合入组标准的UC患者和健康志愿者的一般资料进行记录。通过Mayo评分、组织学评分以及血清炎症因子评估UC严重程度。留取UC患者和健康志愿者的肠粘膜活检标本,进行circRNAs、mRNAs表达谱芯片测序和miRNAs高通量二代测序。应用生物信息学分析相关circRNAs、miRNAs以及mRNAs,预测差异表达circRNAs靶基因,构建circRNAs-miRNAs网络并进行功能富集。研究结果:本研究共纳入30例UC患者和25例健康志愿者。年龄、性别和身体质量指数均匹配的5例UC患者炎症及非炎症肠粘膜和5例健康志愿者肠粘膜进行全转录组学测序。样本相关性分析显示各样本circRNAs、miRNAs、mRNAs数据集呈显著相关,提示该测序实验可靠且样本选择合理。与健康志愿者肠粘膜相比,UC患者炎症肠粘膜中共有11338个circRNAs、321个miRNAs和2149个mRNAs差异表达。UC患者非炎症肠粘膜中共有7261个circRNAs、169个miRNAs、1480个mRNAs差异表达。随后将UC炎症肠粘膜vs健康志愿者肠粘膜的差异基因和UC非炎症肠粘膜vs健康志愿者肠粘膜的差异基因取交集;交集中变化趋势相同的基因作为进一步的研究对象,并构建circRNAs-miRNAs网络。结果显示上调circRNAs构建的网络包含18对circRNAs-miRNAs,下调circRNAs 构建的网络包含 10对circRNAs-miRNAs。CircRNAs-miRNAs 网络功能富集分析显示急性炎症反应、IL-1反应、生物刺激的细胞反应、白细胞迁移、补体和凝血级联和HIF-1信号通路等均参与UC发生发展。研究结论:CircRNAs在UC患者结肠粘膜中表达异常,通过调控多种炎症通路参与UC发生发展。第二部分:Hsacirc0001021参与调控溃疡性结肠炎肠上皮屏障功能研究目的:肠上皮屏障损伤是UC发病的重要因素之一。基于第一部分研究构建的circRNAs-miRNAs网络,利用生物信息学数据库发现hsacirc0001021来源于2号染色体AFTPH基因的外显子。研究表明,AFTPH在结肠上皮细胞表达,在UC患者结肠组织及结肠炎模型小鼠中均下调,通过NF-κB通路调控炎症因子释放。这提示hsacirc0001021可能参与UC肠上皮屏障功能的调节。因此本部分研究利用结肠粘膜标本和结肠上皮细胞系探讨hsacirc0001021在UC中的作用。研究方法:1.hsacirc0001021生物信息学分析:利用数据库进行生物信息学分析,确定hsacirc0001021染色体定位、核苷酸长度、编码蛋白质及其结合miRNA的能力。2.hsacirc0001021在UC患者肠粘膜的表达:通过qRT-PCR方法检测25例UC患者和20例健康志愿者肠粘膜hsacirc0001021的表达水平,并分析其与UC患者Mayo评分、组织学评分、血清血沉（Erythrocyte sedimentation rate,ESR）表达水平的相关性。3.hsacirc0001021对UC肠上皮屏障的影响1)利用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）明确hsacirc0001021的肠粘膜定位。通过临床样本评估hsacirc0001021表达水平与紧密连接蛋白ZO-1、occludin、Cludin-2（CLDN-2）表达的相关性。2)在肠上皮细胞系中下调hsacirc0001021表达,利用异硫氰酸荧光素右旋糖 酐（Fluorescein isothiocyanate-dextran,FD4）通透性分析评估hsacirc0001021对肠上皮细胞旁通透性的影响;利用western blotting实验检测hsacirc0001021对紧密连接蛋白表达的影响。研究结果:1.Hsacirc0001021由1967个核苷酸组成,来源于2号染色体中人AFTPH,由外显子成环,具有miRNA反应元件、RNA结合蛋白区域、开放阅读框。2.Hsacirc0001021在UC患者肠粘膜表达异常且与疾病严重程度相关:qRT-PCR结果显示与健康志愿者肠粘膜相比,hsacirc0001021在UC患者炎症及非炎症肠粘膜均表达下调,其表达水平与UC患者Mayo评分、组织学评分及血清ESR表达水平均呈负相关。3.Hsacirc0001021参与调控肠上皮屏障功能1)FISH染色显示hsacirc0001021定位于肠上皮细胞。UC患者肠粘膜hsacirc0001021表达水平在UC患者肠粘膜中的表达水平与紧密连接蛋白ZO-1、occludin表达呈正相关,与CLDN-2表达呈负相关。2)Si-hsacirc0001021转染HT-29、Caco2细胞后,FD4分析结果显示肠上皮细胞旁通透性明显增加,western blotting结果显示ZO-1、occludin表达降低,CLDN-2表达升高。研究结论:Hsacirc0001021在UC患者炎症和非炎症肠粘膜均表达下调,且与疾病严重程度密切相关。Hsacirc0001021通过影响紧密连接蛋白表达调控肠上皮屏障功能。第三部分:Hsacirc0001021通过吸附miR-224-5p参与溃疡性结肠炎肠上皮屏障损伤的分子机制研究研究目的:CircRNA可通过多种方式发挥生物学功能,如作为miRNA海绵、调节基因剪切、调节转录、与RNA结合蛋白相互作用、调节翻译等。基于第二部分研究,hsacirc0001021来源于外显子,具有miRNA结合位点。FISH染色发现hsacirc0001021位于肠上皮细胞的细胞质,而位于细胞质的circRNA多数通过结合miRNA调控后者靶基因表达发挥作用。这提示hsacirc0001021调控肠上皮屏障功能可能通过竞争性内源性RNA（Competitive endogenous RNA,ceRNA）机制。因此本部分研究利用结肠粘膜标本和结肠上皮细胞系探讨hsacirc0001021参与UC肠上皮屏障功能调控的分子机制。研究方法:1.基于第一部分circRNAs-miRNAs网络及生物信息学分析,确定hsacirc0001021可能与miR-224-5p结合。随后通过生物信息学分析确定miR-224-5p可能的靶基因smad4。2.通过qRT-PCR方法检测miR-224-5p在UC患者肠粘膜表达水平,并评估其与UC严重程度的相关系,且与hsacirc0001021的表达水平进行相关性分析。同时,通过qRT-PCR实验检测smad4在UC患者肠粘膜的表达水平,评估其与UC严重程度的关系,并分析hsacirc0001021与smad4表达的相关性。3.通过荧光素酶实验验证hsacirc0001021与miR-224-5p以及miR-224-5p与smad4的结合。4.在肠上皮细胞系下调hsacirc0001021表达,评估hsacirc0001021对miR-224-5p的调控作用。在肠上皮细胞系上调或抑制miR-224-5p表达,评估miR-224-5p对smad4和紧密连接蛋白表达调控作用。5.挽救实验观察抑制miR-224-5p能否逆转hsacirc0001021介导的smad4以及紧密连接蛋白异常表达。研究结果:1.根据生物信息学分析,本研究筛选miR-224-5p作为hsacirc0001021的下游分子。进一步利用生物信息学分析并结合已有文献确定miR-224-5p的靶基因 smad4。2.MiR-224-5p在UC患者炎症粘膜和非炎症粘膜中表达量均高于健康志愿者,其表达水平与Mayo评分呈正相关,与hsacirc0001021的表达水平呈负相关。Smad4在UC患者炎症粘膜和非炎症粘膜中表达量均低于健康志愿者,与Mayo评分呈负相关,与hsacirc0001021的表达水平呈正相关。UC患者中smad4表达水平与ZO-1、occludin表达呈正相关,与CLDN-2表达呈正相关。3.荧光素酶实验结果表明hsacirc0001021可以结合miR-224-5p,而miR-224-5p与smad4也存在结合。4.HT-29、Caco2 细胞转染 si-hsacirc0001021 后,miR-224-5p 表达上调。HT-29、Caco2 细胞转染 miR-224-5p mimics 后,smad4 表达降低,同时 ZO-1、occludin 表达降低,CLDN-2 表达升高;转染 miR-224-5p inhibitor 后,smad4 表达升高,同时ZO-1、occludin表达升高,CLDN-2表达降低。5.挽救实验表明抑制miR-224-5p能够逆转si-hsacirc0001021介导的smad4 和 ZO-1、occludin 表达下调。研究结论:Hsacirc0001021 作为 ceRNA 吸附 miR-224-5p,上调 smad4 的表达并维持肠上皮屏障功能。