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妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠期间首次出现的糖耐量异常,目前在全球呈上升趋势。GDM母儿出现近远期并发症的风险增加,近期并发症包括:巨大儿、死胎、胎儿畸形、高血压、羊水过多、新生儿呼吸系统疾病综合征、新生儿低钙血症和低血糖、新生儿死亡等;GDM病史的妇女中远期患2型糖尿病（type 2 diabetes,T2DM）的概率为非GDM孕妇的7倍,新生儿将来出现肥胖和代谢性疾病的概率也增加。但是目前GDM的病因和发病机制尚不清楚,但GDM及其并发症的发病机制可能与糖尿病有相似之处。氧化应激和线粒体功能障碍是糖尿病及其并发症的发病机制之一。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡,过多的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）及活性氮自由基（reactive nitrogen species,RNS）通过氧化损伤蛋白质、脂类和DNA等生物大分子,引起组织和细胞结构、功能上的损坏。在糖尿病状态下,高血糖、高脂血症、炎症刺激组织产生大量ROS,ROS长期过量的积累,超过机体抗氧化酶处理能力,引起慢性氧化应激和不同组织细胞的线粒体功能障碍,导致胰岛β细胞功能衰退、胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）和相关并发症的出现。此外,线粒体是脂肪和糖类氧化代谢的主要的亚细胞器官,T2DM患者的胰岛β细胞的线粒体功能降低,导致脂肪积累,促进葡萄糖耐受不良。氧化应激和线粒体功能障碍是糖尿病细胞损伤的重要因素,二者相互作用,参与糖尿病的发生,导致各器官细胞功能障碍,引发心、脑、肾、视网膜等器官的并发症。胎盘是正常妊娠的基础,胎盘功能不良可导致围产期并发症的发生。最新研究发现胎盘氧化应激和线粒体功能障碍可能与GDM的发生发展相关。GDM孕妇的胎盘具有脂毒性,同时合并代谢组织学改变,胎盘中炎症因子和氧化应激增加,而血管生成调节因子减少——这些改变可能破坏了线粒体功能,导致胎盘功能受损,孕产妇出现不良结局。研究胎盘中氧化应激和线粒体的变化有利于探究GDM的发生发展及转归,但是目前GDM胎盘中氧化应激和线粒体损伤的具体分子机制仍不清楚。P66Shc是一种氧化还原酶,参与细胞内氧化应激和细胞凋亡。糖尿病和糖尿病并发症的临床实验及动物实验中均有p66Shc表达增高的报道。糖尿病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 p66Shc mRNA表达增高;糖尿病肾病患者的氧化应激通过p66Shc的激活诱导线粒体破碎;p66Shc的过表达与糖尿病视网膜病变密切相关;抑制p66Shc的表达和ROS的产生可以减轻糖尿病诱导的血管功能障碍;动物实验中,敲除p66Shc基因的小鼠不会出现糖尿病相关并发症,如肾病、神经病变、内皮功能障碍、心肌病及切口愈合延迟。P66Shc蛋白作为氧化应激的传感器,可被高糖高脂激活并直接转位至线粒体,促进ROS的生成,而过量的ROS和p66Shc共同作用,导致线粒体肿胀,进一步引发线粒体功能障碍。一些研究表明p66Shc与线粒体动力学之间也可能存在相互作用,然而,p66Shc介导的线粒体动态改变的机制尚不清楚。线粒体动力学是指线粒体的融合和裂变,线粒体的形态、大小、分布被线粒体融合蛋白 1（mitochondrial fusion protein 1,Mfn1）、视神经萎缩蛋白 1（optic atrophy 1,OPA1）、动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）和线粒体分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1,Fis1）精细调控,以保证细胞的功能。其中Drp1是线粒体分裂所必需的动力蛋白,过表达Drp1分子可以加速线粒体的分裂,从而产生大量片断化的线粒体,引发线粒体功能障碍。有报道在糖尿病肾病中,p66Shc调节Drp1介导线粒体碎片化进而导致肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡。综上所述,我们推测GDM患者体内的氧化应激和线粒体功能障碍可能会导致胎盘功能异常和发育不良,引起围产期并发症,影响胎儿生长发育,而p66Shc可能是其中关键的调控分子。目前,p66Shc在GDM中的表达情况、是否参与GDM胎盘中氧化应激—线粒体损伤及其作用机制均未见报道。本课题将分三部分对此进行探讨。第一部分 妊娠期糖尿病患者外周血中p66Shc的表达及其临床意义研究目的:了解正常妊娠孕妇与GDM孕妇外周血中p66Shc表达水平的差异性,探讨其表达与GDM及其并发症的相关性。研究方法:1.随机选取2016年5月至2017年2月于山东省泰安市中心医院产科分娩的足月妊娠的51例GDM孕妇和25例正常葡萄糖耐量（normal glucose tolerance,NGT）孕妇作为研究对象。在GDM研究人群中,26例孕妇在孕晚期继发出现了GDM围产期并发症（2-GDM）,25例孕妇没有出现围产期并发症（1-GDM）。2.回顾性收集各组妇女早孕期体重及身高,测量其临产前体重、身高,计算身体质量指数（body mass index,BMI）;回顾性收集孕中期各项生化指标:孕中期（24～28周）口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）值、空腹血清胰岛素（fasting serum isulin,FINS）并计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR）;检测分娩前空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、餐后 2 小时血糖（2-hour post-meal blood glucose,2hPBG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,HbA1c）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triacylglycerol,TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）水平。3.收集各组孕妇分娩前外周血,并从外周血中提取PBMCs,荧光实时定量PCR（quantitative real time PCR,qRT-PCR）法检测 p66Shc 在三组 PBMCs 中的mRNA水平的表达。4.比较三组之间各指标的差异性,并分析PBMCs中p66Shc mRNA与各临床指标之间的相关性。研究结果:1.一般临床资料比较2-GDM组、1-GDM组、NGT组三组间的年龄、孕周无统计学差异;2-GDM组的孕前BMI明显高于1-GDM组、NGT组（P=0.001,P＜0.001）,1-GDM组与NGT组之间无明显差异;2-GDM组的产前BMI高于1-GDM组、NGT组,差异具有统计学意义（P＜0.001,P＜0.001）,1-GDM组与NGT组之间差异无统计学意义;2-GDM组的BMI增加量高于1-GDM组、NGT组,差异具有统计学意义（P＜0.05,P＜0.05）,1-GDM 组与 NGT 组无明显差异。2.中孕期（24～28周）OGTT血糖水平及胰岛素敏感性血糖水平:1-GDM 组、2-GDM 组 OGTT-0h、OGTT-1h、OGTT-2h 水平均高于 NGT 组,差异具有统计学意义（P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001;P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001）,1-GDM组与2-GDM组之间无统计学差异。胰岛素敏感性:三组之间的FINS水平无明显差异;2-GDM组HOMA-IR高于NGT组,差异具有统计学意义（P＜0.01）,但是与1-GDM组之间、1-GDM与NGT组之间无明显差异。3.晚孕期（分娩前）血糖、血脂水平和分娩时新生儿情况血糖水平:2-GDM组和1-GDM组FBG水平明显高于NGT组,结果具有统计学差异（P＜0.0001,P＜0.0001）,2-GDM组和1-GDM组无差异性（P=0.068）;2-GDM 组 2hPBG 水平高于 1-GDM 组和 NGT 组（P＜0.0001,P＜0.0001）,1-GDM组和NGT组无差异（P=0.401）;NGT组、1-GDM组、2-GDM组三组间的HbA1c有逐渐增高的趋势,其中2-GDM组与NGT组的差异具有统计学意义（P＜0.01）。血脂水平:三组间的TC、HDL无明显差异;2-GDM组TG水平高于NGT组（P＜0.05）;三组间LDL水平有明显差异:2-GDM组显著高于1-GDM组和NGT组（P＜0.01,P＜0.001）,1-GDM 组亦高于 NGT 组（P＜0.05）。新生儿情况:2-GDM、1-GDM组中新生儿平均体重明显高于NGT组（P＜0.001,P＜0.001）,1-GDM 和 2-GDM 组间无明显差异。4.PBMCs 中 p66Shc mRNA 的表达2-GDM组p66Shc mRNA水平明显高于1-GDM组和NGT组,差异具有统计学差异（P＜0.01,P＜0.001）,1-GDM组p66Shc mRNA水平高于NGT组,但差异无统计学意义。5.p66Shc mRNA与各临床指标的相关性相关性分析表明:在2-GDM组中,p66Shc mRNA与FBG、LDL、TG正相关（r=0.412,P＜0.05;r=0.58,P＜0.01;r=0.412,P＜0.05）;在 1-GDM组中,p66Shc mRNA 与 OGTT-0h、FBG、LDL 正相关（r=0.424,P＜0.05;r=0.446,P＜0.05;r=0.581,P＜0.01）;NGT组中无这种相关性。研究结论:出现并发症的GDM孕妇的外周血中存在p66Shc的表达上调,p66Shc可能参与糖脂代谢,引起GDM及其并发症的发生。第二部分 妊娠期糖尿病患者胎盘中p66Shc的表达与氧化应激的关系研究目的:1.观察GDM患者胎盘的病理学改变和ROS变化,探讨GDM患者胎盘中的氧化应激。2.检测GDM患者胎盘中线粒体分裂蛋白Drp1的表达,探讨GDM患者胎盘中线粒体的变化。3.检测p66Shc在GDM患者胎盘中的表达,分析p66Shc与Drp1表达的相关性。研究方法:1.以2016年5月至2017年2月在山东省泰安市中心医院产科分娩的足月妊娠孕妇作为研究对象。其中出现GDM孕晚期并发症的GDM孕妇（2-GDM组）15例、无并发症的孕妇（1-GDM组）16例、正常孕妇（NGT组）15例。收集三组孕妇的胎盘组织。2.常规HE染色观察2-GDM组、1-GDM组和对照组胎盘的病理改变,DHE染色检测胎盘中ROS水平。3.qRT-PCR检测2-GDM组、1-GDM组和NGT组孕妇胎盘中p66Shc mRNA的表达,免疫组化法分别检测三组胎盘中p66Shc在蛋白水平的表达。4.qRT-PCR法分别检测三组孕妇胎盘中线粒体分裂蛋白Drp1在mRNA水平的表达,免疫组化法分别检测三组孕妇胎盘中Drp1在蛋白水平的表达。5.Pearson相关检测法分析2-GDM组孕妇胎盘中p66Shc mRNA与Drp1 mRNA之间的相关性。研究结果:1.GDM孕妇胎盘的病理变化2-GDM组、1-GDM组、NGT组的胎盘病理切片中母体血管灌注不良和胎儿血管灌注不良的发生率分别为80%（12/15）、37.5%（6/16）、20%（3/15）;2-GDM组相较于1-GDM和NGT组有显著差异（P＜0.05,P＜0.01）,1-GDM与NGT组差异无统计学意义。2.2-GDM组孕妇的胎盘表现出较高的ROS水平2-GDM组孕妇胎盘中ROS水平显著高于1-GDM组和NGT组（P＜0.01,P＜0.01）,1-GDM组和NGT组之间差异无统计学意义。3.p66Shc在2-GDM组孕妇胎盘中的mRNA水平和蛋白水平均呈高表达2-GDM组胎盘中p66Shc mRNA的表达明显高于1-GDM组和NGT组孕妇,结果具有统计学差异（P＜0.05,P＜0.05）。免疫组化结果显示:p66Shc在2-GDM组孕妇胎盘中的蛋白表达明显高于1-GDM组和NGT组（P＜0.05,P＜0.05）,而1-GDM组和NGT组之间无统计学差异。4.Drp1在2-GDM组孕妇胎盘中的mRNA水平和蛋白水平均呈高表达2-GDM组胎盘中Drp1 mRNA的表达均明显高于1-GDM组和NGT组,差异具有统计学意义（P＜0.05,P＜0.05）。免疫组化结果显示:Drp1在2-GDM组胎盘中的蛋白表达水平明显高于1-GDM组和NGT组（P＜0.05,P＜0.01）,在1-GDM组的表达高于NGT组（P＜0.05）。5.2-GDM组孕妇胎盘中p66Shc mRNA的表达与Drp1 mRNA正相关Pearson相关检验法证实p66Shc mRNA与Drp1 mRNA呈正相关（r=0.54,P＜0.05）。研究结论:1.出现并发症的GDM孕妇胎盘中出现了明显的氧化应激,可能与p66Shc的表达上调有关。2.GDM孕妇的胎盘伴有线粒体分裂蛋白Drp1的表达增加,表明出现并发症的GDM孕妇中存在胎盘的线粒体功能障碍。3.出现并发症的GDM孕妇胎盘中p66Shc的表达与Drp1正相关,表明p66Shc可能参与了 GDM胎盘中的线粒体损伤。第三部分 高葡萄糖作用下人绒毛膜滋养细胞中p66Shc对线粒体动力学及氧化损伤的影响和机制研究研究目的:1.检测高葡萄糖刺激下p66Shc在JEG3中表达的变化。2.检测高葡萄糖环境下JEG3中Drp1的表达和ROS的变化。3.探究JEG3中p66Shc的表达变化与氧化应激和线粒体损伤的关系,探讨p66Shc在GDM中的作用和机制。研究方法:1.体外培养人绒毛膜滋养细胞JEG3,于正常葡萄糖浓度（5.5mM）和高葡萄糖浓度（15mM,30mM）中分别培养24小时,蛋白印迹实验（Western Blot）测定Drp1在蛋白水平的表达。2.将JEG3细胞分别在正常葡萄糖中培养24小时,在高浓度葡萄糖中培养24小时、48小时、72小时,利用qRT-PCR和Western Blot技术测定p66Shc、Drp1的mRNA水平和蛋白水平的表达。3.MitoTracker Red染色和DHE染色检测不同葡萄糖浓度下JEG3细胞中线粒体状态和ROS水平。4.分别将未转染的JEG3细胞（正常空白组）、转染质粒p66Shc的JEG3细胞（过表达正常培养组）于5.5mM葡萄糖中培养24小时,将未转染的JEG3细胞（高糖空白组）、转染si p66Shc的细胞（高糖沉默组）于30mM葡萄糖中培养24小时,qRT-PCR检测Drp1 mRNA的表达,DHE法检测JEG3细胞中ROS的表达,MitoTracker Red染色检测细胞中线粒体膜电位水平。研究结果:1.不同葡萄糖浓度对JEG3中Drp1的表达的影响与正常葡萄糖（5.5mM）组相比,30mM葡萄糖下Drp1的表达明显增高,差异具有统计学意义（P＜0.01）,5.5mM和15mM之间无统计学差异。后续实验选择30mM葡萄糖浓度为高糖组。2.高葡萄糖环境下p66Shc、Drp1在JEG3中的表达增强高糖组中p66Shc、Drp1 mRNA水平高于正常培养组,差异具有统计学意义（P＜0.05,P＜0.05）;高糖组p66Shc、Drp1的蛋白水平表达也明显高于正常培养组,差异具有统计学意义（P＜0.01,P＜0.05）。3.高葡萄糖环境下p66Shc、Drp1在JEG3中的表达随着时间的增加逐渐增强随着时间的增加,p66Shc mRNA、Drp1 mRNA的表达呈逐渐增加的趋势。各组与正常培养组比较均具有差异性,时间越长,差异性越显著（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01;P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。Western Blot 也证实了这种趋势。后续实验选择均培养24小时。4.高葡萄糖环境下JEG3的ROS水平增强高糖组红色荧光强度显著高于正常培养组,表明ROS表达增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.高浓度葡萄糖刺激下JEG3中线粒体动力学变化正常糖浓度（5.5mM）环境下,JEG3的线粒体均匀分布于胞浆,形态为长管状或者细丝状;在高浓度葡萄糖（30mM）环境中,JEG3的线粒体分布弥散,形态为圆点或碎裂状,线粒体出现碎片化（P＜0.01）。6.p66Shc对JEG3中Drp1表达的调控在正常培养条件下,与空白组相比,过表达p66Shc后正常培养组的JEG3细胞中的Drp1 mRNA表达增高（P＜0.01）;高浓度葡萄糖刺激JEG3后,高糖空白组的Drp1mRNA的表达较正常空白组表达增加,这与前面的实验结果一致,当沉默p66Shc后,在同等高糖培养刺激下,与高糖空白组相比,发现高糖沉默组Drp1表达降低（P＜0.05）,差异具有统计学意义。7.p66Shc对JEG3中ROS表达的调控在正常糖培养条件下,与空白组相比,过表达p66Shc后正常培养组的JEG3细胞中的ROS表达增强（P＜0.01）;高浓度葡萄糖刺激JEG3后,高糖空白组的ROS的表达较正常空白组增强,这与前面的实验结果一致,当沉默p66Shc后,在同等高糖刺激下,与高糖空白组相比,发现高糖沉默组ROS表达降低（P＜0.01）,差异具有统计学意义。8.p66Shc对JEG3中线粒体膜电位的影响正常葡萄糖浓度下,与空白组相比,过表达p66Shc后正常培养组的JEG3细胞中红色荧光减弱（P＜0.05）;高葡萄糖浓度下,高糖空白组的JEG3细胞相较于正常空白组JEG3细胞中的红色荧光减弱（P＜0.01）,沉默p66Shc后,同样高糖下高糖沉默组JEG3细胞中红色荧光高于高糖空白组的JEG3细胞（P＜0.05）。研究结论:1.高浓度葡萄糖培养条件下,滋养细胞内氧化应激及线粒体功能障碍明显增加。2.高浓度葡萄糖刺激滋养细胞内p66Shc表达增加,通过正调控Drp1和ROS的表达,导致线粒体损伤。3.P66Shc可能是GDM及其并发症发病机制中的的重要调控分子。