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人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,RSV）于 1 956 年被发现并迅速成为全球婴幼儿急性下呼吸道感染的首要病原,同时也是老年人和免疫缺陷病人死亡的重要病原。在过去的60余年中,尽管RSV感染复制相关机制慢慢被揭示,与宿主相互作用不断被发现,RSV组成蛋白质结构与功能不断被报道,RSV转录/复制具体机理依然不全完明确,抗RSV药物研究进展缓慢。目前,临床治疗RSV感染的唯一许可药物是广谱抗病毒药物利巴韦林,由于其他副作用,并不适用于临床常规RSV感染病例。此外,F蛋白人源化单克隆抗体帕丽珠（Palivizumab）可用于高危婴幼儿的预防,治疗单价高,且需要每月注射。因此,目前的RSV感染的临床应对仍局限于辅助性治疗,如增加供氧。这就迫切需要新的、有效的和成本低高的治疗方法。本课题组前期的研究中,我们首次发现并报道了环靶明能够抑制RSV复制,通过药物浓度压力实验,检测到M2-1基因突变M2-1 R151K,环靶明（Cyclopamine,CPM）是一种异甾体类生物碱,对多种肿瘤都有良好的抑制作用,CPM抑制RSV复制特性与作用分子机制需要进一步探索。此外,随着联合用药在抗肿瘤以及其他病毒领域的应用,联合用药能够有效的降低耐药突变概率并降低药物用量,不同类型抑制剂组合使用抗RSV有潜力成为RSV治疗替代策略,目前尚无相关研究报道。本论文研究首先从RSV Luc重组毒株出发,进行了病毒增殖特性分析,证明了 Luciferase报告基因的插入并不降低病毒的滴度,不影响细胞合胞体的形态和大小。建立了快速抗RSV药物筛选模型,大大缩短了抗RSV实验周期,从传统方法超过一周的时长缩短至48小时,并分别用两种已知的融合抑制剂GS5806和RdRp抑制剂CPM验证了系统的可应用性。此外,我们通过构建突变基因质粒,进行RdRp（N,P,L,M2-1）依赖的带有报告基因的微基因组实验,应用微基因组系统验证了 M2-1 R151K突变不影响M2-1转录抗终止子功能,以及M2-1 R151K对CPM的耐受性。最近的文章报道了在转录/复制活跃期,包涵体IB中会形成动态平衡的亚结构包涵体相关粒子（IBAG）,IBAG结构是仅有M2-1与mRNA聚集形成的动态结构,为了探索CPM抑制RSV复制机制,通过活细胞工作站,动态分析了 CPM抑制RSV复制过程,揭示了 CPM急速抑制M2-1参与的IBAG动态结构的形成,能在数分钟内,解聚所有IBAG结构,并且不再重新形成IBAG。第二部分验进行了 CPM抑制RSV复制的分子机理探究。通过第一章CPM抑制RSV特性及现象分析,我们将M2-1作为CPM抗RSV分子机理的出发点,首先构建原核表达质粒载体,诱导表达并纯化得到M2-1蛋白和M2-1 R151K突变蛋白,首先进行了化合物与两株蛋白的直接互作实验,通过微量热泳动实验（MST）发现野生蛋白与突变蛋白均不与CPM直接结合。结合前文实时荧光显色实验结果,我们分析CPM对M2-1功能的抑制可能会涉及到与RNA的相互作用。随后进行了表面等离子共振实验（SPR）发现:野生型M2-1与RNA的平衡解离常数为2.704 E-5 M,当加入0.5 μM的CPM后,M2-1与RNA的结合能力大大减弱,M2-1与RNA的解离常数为8.228E-5 M;另一方面,M2-1 R151K蛋白与RNA结合的解离常数为2.918E-5 M,与野生型蛋白M2-1结合RNA的能力相当,当加入0.5 μM的CPM溶液后,M2-1 R151K与RNA结合的解离常数为3.594E-5M。我们得出结论:CPM抑制M2-1蛋白功能的机制是抑制M2-1与RNA结合,CPM对突变蛋白M2-1 R151K与RNA的结合几乎没有影响。第三部分我们对不同RSV病毒靶点抑制剂进行了联合用药抗病毒效果评估体外实验。应用第一部分所建立的药物药效评价模型,以Luciferase酶活检测为指标,应用病毒学常用的MacsynergyⅡ应用程序分析联合处理时药物相互作用,选取 RSV 融合抑制剂（GS5806、Ziresovir、BMS433771）与 RdRp 抑制剂（ALS8176、RSV604、CPM）共6种抑制剂,两两组合,联合使用。发现ALS8176与三种融合抑制剂体外联用均表现出叠加效应。RSV604与GS5806、Ziresovir联用表现出叠加效应。RSV604与BMS433771联用表现出轻微协同效应,CPM与三种融合抑制剂联用均表现出叠加效应。三种RdRp抑制剂联合使用均表现出叠加效应。GS5806与Ziresovir组合表现为叠加效应,GS5806与BMS433771联合使用表现为轻微拮抗效应,与之前报道的RSV对不同融合抑制剂存在交互抗性的结论一致,相同作用机制的药物竞争性的结合同一个靶点,造成药物之间的相互拮抗。在联合用药抗RSV方面应用不同靶标的抑制剂（F抑制剂和RdRp抑制剂）进行组合,抗病毒效果更好。最后一部分我们探究了宿主细胞抑制剂与病毒抑制剂联用抗RSV体外效果评价。CPA是细胞内钙ATP酶抑制剂,通过提高细胞内钙离子浓度实现RSV病毒复制的抑制,但CPA细胞毒性较高。因此,本章实验,我们选取低浓度CPA分别与第三部分6种RSV抑制剂联合使用进行了体外抗RSV实验,依照第三章相同的实验与分析方法,结果表明宿主抑制剂CPA分别与GS5806和Ziresovir联用时,均会产生轻微协同效应;与BMS433771联合使用时,表现为强协同效应;CPA与ALS8176联合使用实验中,3 μM的CPA与不同浓度ALS8176联用,会产生叠加效应,更低浓度的CPA与ALS8176联用表现出轻微协同效应;RSV604与CPA联合使用,表现出叠加效应;CPM与CPA联合应用,会产生强协同效应。综上所述,我们首先建立了稳定高效的抗RSV药物筛选模型,可大大加快抗RSV药物发掘进程;通过对CPM抗RSV特性与现象分析,我们选取转录抗终止子M2-1为切入点,探明了 CPM抑制RSV病毒复制是通过抑制M2-1＆RNA的相互作用来实现,而R151K突变赋予了 M2-1＆RNA互作对CPM的耐受性,且不减弱蛋白的转录延伸功能;此外,我们对不同RSV抑制剂组合进行了体外联合用药抗病毒研究,结果表明联合用药抗RSV方面应用不同靶标的抑制剂（F抑制剂和RdRp抑制剂）进行组合,抗病毒效果更好。在此基础上,我们对宿主抑制剂与病毒抑制剂组合体外抗病毒效果进行了评估,探究了宿主抑制剂与不同种类的病毒抑制剂联用,具有较好的抗病毒效果,由于人类基因相较于单链RNA病毒基因组更加稳定,我们认为宿主靶标抑制剂-病毒靶标抑制剂联用在未来抗RSV治疗方案开发与降低耐药突变方向有较高的潜力。