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背景和目的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。2020年全球癌症统计报告显示,结直肠癌在全球癌症中发病率位居第三,死亡率位居二。目前,随着早期系统性的筛查和治疗技术的不断提高,发达国家结直肠癌患者死亡率呈下降趋势。然而,在许多发展中国家死亡率仍在迅速上升。2020年中国癌症统计显示结直肠癌是我国第二常见的恶性肿瘤,死亡率位居第五,其中结肠癌的发病率显著上升,且部分患者确诊时已处于中晚期,严重威胁到居民身心健康甚至生命安全,给家庭和社会造成了重大医疗经济负担。结直肠癌的转移,尤其是远处癌转移,是影响患者预后和导致死亡的主要原因,几乎所有的结直肠癌患者都有癌转移的风险,约90%的癌症相关性死亡是由转移引起的。目前,手术治疗是结直肠癌主要的治疗手段,而化疗作为术后主要治疗手段之一,对结直肠癌的益处是毋庸置疑的,但同时存在的耐药性和副作用也是不容忽视。因此,迫切需要一种新的药物或策略来不仅可以抑制结直肠癌的转移,同时能够有效减少化疗的不良反应。二甲双胍是双胍类口服降糖药,由于其疗效确切、价格低廉而且相对耐受性良好,故许多糖尿病诊疗指南均推荐二甲双胍作为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）的一线降糖药。二甲双胍降血糖的原理主要是降低肝脏糖异生和改善胰岛素敏感性,不会引起低血糖反应。由于糖代谢功能功能紊乱与肿瘤发病风险之间存在显著相关性,所以近年来,人们开始关注到糖尿病治疗药物与肿瘤预防和治疗的关系。研究表明二甲双胍对多种肿瘤起到一定的抑制作用。二甲双胍不仅可以抑制体外肿瘤细胞系的增殖、侵袭和迁移,还可以抑制人体内和动物模型中实体肿瘤转移。目前,二甲双胍对结直肠癌的作用尚有争议。一些研究发现二甲双胍可以降低2型糖尿病患者结直肠癌的发病风险和结直肠癌的死亡率。相反,有研究发现二甲双胍对结直肠癌的发病率和生存期无保护作用。此外,大多数研究都是在2型糖尿病合并结直肠癌患者中进行的,二甲双胍对非糖尿病患者结直肠癌的作用尚未被广泛探讨。基于二甲双胍的抗肿瘤作用,研究者们广泛开展了二甲双胍联合不同化疗药物对肿瘤作用的研究。研究表明,二甲双胍可以显著增强不同肿瘤细胞对顺铂、卡铂、阿霉素、紫杉醇等化疗药物的敏感性,当二甲双胍和不同化疗药物联合应用时抗肿瘤效果显著增强。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）是结直肠癌的基础化疗药物之一,广泛应用于临床Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者,是目前唯一可以改善结直肠癌患者12个月生存率的化疗药物。但是,5-FU单药治疗晚期结直肠癌患者的总缓解率仅仅约10-15%,生存率未见显著改善,5-FU联合其它化疗药物治疗的有效率也不足50%。肿瘤细胞对5-FU的先天性和获得性耐药严重影响了其化疗作用,并且部分5-FU治疗患者会出现严重的毒副作用。有研究发现二甲双胍能够显著提高5-FU对结直肠癌细胞株的抗增殖能力,但是二甲双胍联合5-FU对结直肠癌侵袭和转移的作用尚不清楚。因此,为了探索二甲双胍联合5-FU对结直肠癌增殖和转移的作用及其可能作用机制,本研究在体外细胞学实验中检测了二甲双胍联合5-FU对结直肠癌细胞株HCT116和SW1463增殖和侵袭的影响;在体内通过裸鼠大肠癌盲肠原位种植模型,观察二甲双胍联合5-FU对结直肠癌生长和转移的影响;此外基于串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记定量蛋白质组学技术和生物信息学分析进一步探讨了二甲双胍及联合5-FU抑制结直肠癌增殖和转移的可能作用机制。本研究具体内容包括以下三部分:第一部分二甲双胍联合5-FU对体外结直肠癌细胞株HCT116和SW1463增殖和侵袭的影响目的:探讨二甲双胍联合5-FU对结直肠癌细胞株HCT116和SW1463增殖和侵袭的影响。方法:1.选取人结肠癌细胞株HCT116和人直肠癌细胞株SW1463为实验对象。2.CCK-8法检测不同浓度二甲双胍（0,1mM,5mM,10mM,20mM和40mM）或 5-FU（0,5μM,50μM,100μM,200μM 和 300μM）作用 24h 后两种细胞株的细胞存活率。然后,分别计算二甲双胍和5-FU对两种细胞株的抑制浓度（Inhibition C oncentration,IC）,根据药物使用浓度≤半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）及组间平行性（可比性）选取合适的二甲双胍和5-FU浓度用于后续实验浓度。CCK-8法检测二甲双胍联合不同浓度5-FU作用24h后两种细胞株的细胞存活率。3.平板克隆形成实验分别检测二甲双胍、5-FU及二甲双胍+5-FU联合用药对两种细胞株克隆形成能力的影响。4.Transwell侵袭实验检测分别检测二甲双胍、5-FU及二甲双胍+5-FU联合用药对两种细胞株侵袭能力的影响。结果:1.CCK-8法检测显示:不同浓度二甲双胍（0,1mM,5mM,10mM,20mM 和 40mM）或 5-FU（0,5μM,50μM,100μM,200μM 和 300μM）对结直肠癌细胞株 HCT116和SW1463增殖均有抑制作用,并且随着药物浓度的增高,抑制增殖的作用逐渐增强。细胞株 HCT116 和 SW1463 的二甲双胍 IC50 分别是 4.6mM、13.6mM,5-FU IC50 分别是 4.8μM、1269.0μM。5mM 二甲双胍和 5μM 5-FU 均接近于 HCT116细胞的IC50、SW1463细胞的IC25,根据药物使用浓度≤IC50及组间平行性（可比性）,后续实验中选择的二甲双胍浓度为5mM,5-FU浓度为5μM。与单用5-FU相比,二甲双胍联合不同浓度5-FU可以显著抑制HCT116和SW1463细胞增殖（均P＜0.05）。2.平板克隆形成实验检测显示:与对照组（41.3±4.0）相比,二甲双胍组（23.3±3.5）、5-FU 组（24.7±5.5）和二甲双胍+5-FU联合用药组（5.7±1.5）HCT116细胞克隆形成数目均显著下降（均P＜0.05）;与5-FU组（24.7±5.5）相比,二甲双胍+5-FU联合用药组（5.7±1.5）HCT116细胞克隆形成数目显著下降（P＜0.05）。与对照组（132.3±31.6）相比,二甲双胍组（69.7±11.2）、5-FU 组（75.0±13.2）和二甲双胍+5-FU联合用药组（37.7±16.3）SW1463细胞克隆形成数目均显著下降（均P＜0.05）;与5-FU组（75.0±13.2）相比,二甲双胍+5-FU联合用药组（37.7±16.3）SW1463细胞克隆形成数目显著下降（P＜0.05）。3.Transwell侵袭实验检测显示:与对照组（69.8±11.2）相比,二甲双胍组（38.6±9.7）和二甲双胍+5-FU联合用药组（23.0±7.1）HCT116细胞侵袭细胞数显著下降（均P＜0.05）,5-FU组（51.0±16.3）HCT116细胞侵袭细胞数无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（51.0±16.3）相比,二甲双胍+5-FU联合用药组（23.0±7.1）HCT116细胞侵袭细胞数显著下降（P＜0.05）。与对照组（87.8±9.5）相比,二甲双胍组（50.2±9.8）和二甲双胍+5-FU联合用药组（37.8±9.5）SW1463细胞侵袭细胞数显著下降（均P＜0.05）,5-FU组（76.6±13.0）SW1463细胞侵袭细胞数无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（76.6±13.0）相比,二甲双胍+5-FU联合用药组（37.8±9.5）SW1463细胞侵袭细胞数显著下降（P＜0.05）。结论:二甲双胍可以抑制体外结直肠癌细胞株HCT116和SW1463的增殖及侵袭;二甲双胍和5-FU联合用药时具有协同作用,能显著增加对结直肠癌细胞增殖和侵袭的抑制作用。第二部分二甲双胍联合5-FU对裸鼠体内结直肠癌生长和转移的影响目的:通过在裸鼠体内构建大肠癌盲肠原位种植模型,观察二甲双胍联合5-FU对结直肠癌生长和转移的影响。方法:1.裸鼠皮下种植瘤模型的建立将HCT116细胞悬液注射于5周龄雄性裸鼠皮下,在接种后第4～5周,肿瘤生长至直径1.5cm时,将肿瘤取出并切割成约1mm3大小的组织块备用。2.裸鼠体内大肠癌盲肠原位种植模型的构建选取20只生长状态良好的5周龄雄性裸鼠,10%水合氯醛0.3 ml/100g（体重）麻醉,75%酒精消毒后使用无菌眼科器械在其左下腹部做一长约0.5cm的切口进腹,钳出盲肠,轻轻刮除盲肠浆膜,使用无菌眼科缝线将备用的1mm3大小皮下种植瘤缝合于盲肠壁上。随后,将盲肠回纳腹腔,逐层关腹。3.药物干预大肠癌模型裸鼠:大肠癌盲肠原位种植模型构建一周后,将20只裸鼠随机分成4组（n=5）:对照组、二甲双胍组、5-FU组、联合用药组（二甲双胍+5-FU组）。二甲双胍组按250mg/kg剂量,每天一次,灌胃法给药;5-FU组按25 mg/kg剂量,每周一次,腹腔注射法给药;联合用药组则行二甲双胍灌胃与腹腔注射5-FU法联用;对照组选用腹腔注射等体积生理盐水。用药时间4周,4周后采用颈椎脱臼法处死,解剖并观察盲肠原位种植癌生长及转移情况。取出原位种植癌灶及可疑转移癌灶,测量其体积和重量,然后部分切成小块后放于液氮中冻存,部分浸泡于中性福尔马林中固定用于石蜡包埋。4.免疫组织化学Ki-67染色检测原位种植癌增殖指数。结果:1.原位种植癌体积:与对照组（1097.9±603.6 mm3）相比,5-FU组（237.6±131.3 mm3）和联合用药组（224.5±79.3 mm3）原位种植癌的体积显著减小（均P＜0.05）。与对照组（1097.9±603.6 mm3）相比,二甲双胍组（768.3±224.0 mm3）原位种植癌的体积无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（237.6±131.3 mm3）相比,联合用药组（224.5±79.3 mm3）原位种植癌的体积无显著差异（P＞0.05）。2.原位种植癌重量:与对照组（1.00±0.35 g）相比,5-FU组（0.48±0.34 g）和联合用药组（0.42±0.24 g）原位种植癌的重量显著减小（均P＜0.05）。与对照组（1.00±0.35 g）相比,二甲双胍组（0.88±0.20 g）原位种植癌的重量无显著差异（P＞0.05）。与 5-FU 组（0.48±0.34 g）相比,联合用药组（0.42±0.24 g）原位种植癌的重量无显著差异（P＞0.05）。3.大体解剖和显微镜下观察显示:对照组和5-FU组裸鼠出现多处远处转移,远处转移部位/器官包括:胰腺、肝脏、小肠、网膜、肾被膜下;二甲双胍组和联合用药组裸鼠仅出现了肝转移。与对照组（5/5,100%）相比,二甲双胍组（1/5,20%）和联合用药组（1/5,20%）远处转移率显著降低（均P＜0.05）。与5-FU组（4/5,80%）相比,联合用药组（1/5,20%）远处转移率无显著差异（P＞0.05）。4.原位种植癌Ki-67增殖指数:与对照组（93.6%±3.5%）相比,二甲双胍组（74.0%±6.5%）、5-FU 组（70.0%±7.9%）和联合用药组（56.0%±6.5%）Ki-67增殖指数显著降低（均P＜0.05）。与5-FU组（70.0%±7.9%）相比,联合用药组（56.0%±6.5%）Ki-67增殖指数显著降低（P＜0.05）。结论:二甲双胍可以抑制裸鼠体内结直肠癌的增殖和远处转移,二甲双胍和5-FU联合用药时具有协同作用,能显著增加对结直肠癌增殖和远处转移的抑制作用。第三部分二甲双胍及联合5-FU抑制结直肠癌增殖和转移的作用机制研究目的:运用串联质谱标签（TMT）标记定量蛋白质组学技术和生物信息学分析探讨二甲双胍及联合5-FU抑制结直肠癌增殖和转移的可能作用机制。方法:1.随机选取液氮中冻存的对照组和二甲双胍组裸鼠原位种植癌组织各3例,共计6个样本。2.利用同位素标记相对和绝对定量TMT技术对上述样本进行蛋白质组学分析,筛选出对照组和二甲双胍组原位种植癌组织的差异表达蛋白质。3.运用生物信息学分析,包括聚类分析、GO功能注释和富集分析、KEGG通路注释和富集分析等方法,进一步分析差异蛋白质的分子功能、所参与的生物过程、细胞组分和信号转导通路,从而筛选出与本研究中结直肠癌细胞增殖和转移密切相关的关键调控蛋白质。4.Western Blot验证原位种植癌中相关差异蛋白质表达结果。5.免疫组织化学染色验证原位种植癌中相关差异蛋白质表达结果。结果:1.TMT蛋白质组学分析筛选出二甲双胍组和对照组差异表达蛋白质70个,其中上调的差异蛋白质17个,下调的差异蛋白质53个。2.GO功能注释和富集分析显示,70个差异蛋白质中CDKN1A、GDF15和CRIP1三个蛋白质与细胞增殖和转移功能密切相关。CDKN1A蛋白质主要与细胞周期、负调控上皮细胞增殖、细胞程序性死亡、细胞周期蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂等功能有关;GDF15蛋白质主要与细胞生长因子活性、负调控上皮细胞增殖、负调控细胞迁移、细胞粘附、负调控血管发育等功能有关;CRIP1蛋白质主要与免疫反应、细胞对有机物及抗生素的反应、肌动蛋白丝的解聚和切断、DNA双链断裂的修复、构成细胞骨架等功能有关。蛋白质定量和差异性分析显示二甲双胍组癌组织中,CDKN1A蛋白质表达量显著上调,是对照组的1.254倍;GDF15蛋白质表达量显著上调,是对照组的1.859倍;CRIP1蛋白质表达量显著下调,是对照组的0.733倍。KEGG通路注释和富集分析显示70个差异蛋白质显著影响的代谢和信号转导途径有117条,其中CDKN1A参与了 P53、PI3K-Akt、ErbB等多条信号通路,GDF15参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。3.Western Blot验证原位种植癌中CDKN1A、GDF15和CRIP1蛋白质表达结果。与对照组（1.0±0.0）相比,二甲双胍组（4.1±1.3）、5-FU组（6.3±1.3）和联合用药组（9.6±2.7）原位种植癌中CDKN1A蛋白质表达显著升高（均P＜0.05）。与5-FU组（6.3±1.3）相比,联合用药组（9.6±2.7）CDKN1A蛋白质表达显著升高（P＜0.05）。与对照组（1.0±0.0）相比,二甲双胍组（3.5±1.5）和联合用药组（5.4±2.2）原位种植癌中GDF15蛋白质表达显著升高（均P＜0.05）,5-FU组（1.4±0.4）GDF15蛋白质表达无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（1.4±0.4）相比,联合用药组（5.4±2.2）GDF15蛋白质表达显著升高（P＜0.05）。与对照组（1.0±0.0）相比,二甲双胍组（0.6±0.1）和联合用药组（0.3±0.1）原位种植癌中CRIP1蛋白质表达显著下降（均P＜0.05）,5-FU组（0.8±0.1）CRIP1蛋白质表达无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（0.8±0.1）相比,联合用药组（0.3±0.1）CRIP1蛋白质表达显著下降（P＜0.05）。4.免疫组织化学验证原位种植癌中CDKN1A、GDF15和CRIP1蛋白质表达结果。与对照组（1.4±1.3）相比,二甲双胍组（3.4±1.1）、5-FU组（4.6±0.9）和联合用药组（6.0±0.7）原位种植癌中CDKN1A蛋白质染色积分显著升高（均P＜0.05）。与5-FU组（4.6±0.9）相比,联合用药组（6.0±0.7）CDKN1A蛋白质染色积分显著升高（P＜0.05）。与对照组（0.8±1.1）相比,二甲双胍组（4.6±0.5）和联合用药组（5.6±0.5）原位种植癌中GDF15蛋白质染色积分显著升高（均P＜0.05）,5-FU组（1.4±1.3）GDF15蛋白质染色积分无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（1.4±1.3）相比,联合用药组（5.6±0.5）GDF15蛋白染色积分显著升高（P＜0.05）。与对照组（6.2±0.8）相比,二甲双胍组（4.4±0.5）和联合用药组（2.8±0.8）原位种植癌中CRIP1蛋白质染色积分显著下降（均P＜0.05）,5-FU组（5.4±1.1）CRIP1蛋白质染色积分无显著差异（P＞0.05）。与5-FU组（5.4±1.1）相比,联合用药组（2.8±0.8）CRIP1蛋白质染色积分显著下降（P＜0.05）。结论:多种蛋白质参与了二甲双胍对结直肠癌的抑制作用,其机制可能与上调CDKN1A和CDF15、下调CRIP1蛋白质表达有关。这三个蛋白质可能是二甲双胍联合5-FU协同抑制结直肠癌增殖和转移的关键蛋白质。