论文部分内容阅读
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国重要的特色水产养殖品种,在创造可观经济效益的同时也遭受细菌性等疾病的困扰,成为了制约该蟹健康养殖及可持续发展的重要瓶颈问题之一。包括该蟹在内的无脊椎动物缺失适应性免疫,仅依赖固有免疫完成对病原微生物入侵的抵御。因此,深入解析中华绒螯蟹固有免疫反应的运作机理将进一步充实对无脊椎动物固有免疫反应体系的理解,为该蟹乃至其它甲壳动物的疾病防控提供理论依据,为甲壳动物的抗病育种提供潜在靶标。本论文以中华绒螯蟹为研究对象,基于其基因组和转录组数据鉴定了一种含有免疫球蛋白（Ig）结构域和C-型凝集素样结构域（CTLD）的新型C-型凝集素（EsIgLectin）,并发现该基因在中华绒螯蟹血细胞及各组织中均广泛表达。在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）经附肢或口器注射中华绒螯蟹后,EsIgLectin的m RNA和蛋白表达在血细胞及肠道中均极显著上调,暗示其可能在抗菌免疫反应中具有重要作用。在对Ig及CTLD结构域的研究中发现,上述两个结构域在细菌结合、促进细菌凝集、抑制细菌生长以及细菌清除功能中具有协同作用。其中,CTLD中QPD基序的缺失会导致其细菌结合、促进细菌凝集、抑制细菌生长以及细菌清除的能力极显著下降;生物信息学分析发现EsIgLectin中的6个半胱氨酸残基可潜在产生3对二硫键,通过化学交联剂BS3处理及还原和非还原的蛋白上样缓冲液处理后,经SDS-PAGE和western blot检测发现EsIgLectin可通过Ig结构域形成蛋白多聚体。进一步的研究发现,二硫键缺失的Ig结构域重组蛋白(r Es IgΔCys42,102和r EsIgLectinΔCys42,102)均不能形成多聚体,且会导致细菌抑制和清除能力的极显著降低。上述结果表明,CTLD及Ig结构域在EsIgLectin的抗菌功能中具有重要作用。为研究EsIgLectin作为分泌型蛋白通过血细胞膜表面受体调控细胞免疫的潜力,本论文通过激光共聚焦技术分别检测了EsIgLectin的重组蛋白（r EsIgLectin、r Es Ig和r Es CTLD）与血细胞的结合和黏附能力,结果表明仅Ig结构域可结合并黏附至中华绒螯蟹血细胞膜表面。进一步的研究发现,上述结构域的重组蛋白中,r EsIgLectin和r Es Ig具有显著促进中华绒螯蟹血细胞吞噬细菌的能力,暗示Ig结构域可能存在相互作用的细胞膜表面受体。基于中华绒螯蟹血细胞T7噬菌体文库的筛选发现,r Es Ig具有与多聚免疫球蛋白受体（Esp IgR）互作的可能,而进一步的GST pull-down实验不仅证实了上述蛋白质相互作用,且明确了EsIgLectin的Ig结构域结合Esp IgR细胞外Ig1结构域的作用机理。在此基础上,研究发现副溶血弧菌刺激会导致血细胞Esp IgR基因m RNA水平的极显著上调,血细胞Esp IgR的敲降可明显抵消r EsIgLectin和r Es Ig对血细胞细菌吞噬能力的促进作用。上述结果表明,EsIgLectin可通过Esp IgR调控中华绒螯蟹血细胞吞噬细菌。荧光原位杂交实验显示EsIgLectin在肠道上皮细胞表达,且经口注射副溶血弧菌后肠道EsIgLectin的m RNA水平显著上调。为研究EsIgLectin在肠道中潜在的免疫功能,通过经口注射r EsIgLectin、r Es Ig和r Es CTLD到中华绒螯蟹并对其肠道内容物进行16S r DNA测序,结果发现经口注射r EsIgLectin、r Es Ig和r Es CTLD能改变中华绒螯蟹肠道菌群的α和β多样性以及菌群结构,使得肠道有益菌增加病原菌减少从而调控肠道菌群稳态。通过经口注射副溶血弧菌或者r EsIgLectin、r Es Ig和r Es CTLD建立了肠炎模型和肠炎拯救模型。在拯救模型中发现注射r EsIgLectin和r Es Ig后肠道上皮细胞密度增加、从基底膜脱落的上皮细胞变少以及肠壁变厚等明显的肠炎缓解现象,而注射r Es CTLD后肠炎并未得到缓解,上述结果表明EsIgLectin缓解肠炎与Ig结构域密切相关。研究还发现在肠炎的发生过程中肠道Esp IgR的m RNA水平持续上调,而血细胞EsIgLectin的m RNA水平在肠炎后期才迅速上调。通过在肠炎早期和后期分别经口注射FITC标记的副溶血弧菌发现,只有在肠炎后期的血淋巴中可以检测到FITC信号,这表明在肠炎后期副溶血弧菌可以由肠道外溢到血淋巴从而诱导EsIgLectin的m RNA水平上调。并且通过在肠炎早期和后期附肢注射r EsIgLectin发现在肠炎后期血淋巴中的EsIgLectin能通过Esp IgR转运到肠道行使功能。在初步建立EsIgLectin-Esp IgR轴之后,为研究这种轴是否对中华绒螯蟹的生存产生影响。本论文通过RNA干扰技术发现敲降EsIgLectin或者Esp IgR后,经口或者附肢注射副溶血弧菌会导致中华绒螯蟹的死亡率显著增加。而注射r EsIgLectin、r Es Ig或者r Es CTLD和副溶血弧菌会降低中华绒螯蟹的死亡率,并且降低的死亡率存在重组蛋白剂量依赖性。此外,通过先敲降Esp IgR再注射r EsIgLectin和副溶血弧菌发现EsIgLectin会以Esp IgR依赖的方式影响中华绒螯蟹的死亡率。综上所述,本论文揭示EsIgLectin通过肠道-血细胞轴调控中华绒螯蟹的抗菌免疫,不仅丰富了甲壳动物固有免疫理论,也为虾蟹等甲壳动物疾病防控提供了新思路。