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研究背景:七氟醚和异氟醚是两种常用的挥发性麻醉剂,与其他静脉注射或吸入麻醉剂相比有许多优点,包括血气分配系数低,诱导迅速等。研究发现发育期大鼠暴露于吸入性麻醉药,会导致发育期中枢神经系统神经元突触生长异常和神经元凋亡,对远期学习能力可能造成影响。并且不同种类的吸入性麻醉药造成的损伤可能有差异。儿科神经学专家Johnolney及其同事首次发现胎儿晚期或新生儿早期,阻断N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）谷氨酸受体仅数小时,就可引起发育中的大鼠脑内广泛的凋亡性神经变性,提示兴奋性神经递质谷氨酸（Glu）在NMDA受体作用下促进神经元发育。目前还没有前瞻性研究评估新生儿接触麻醉药后的神经认知功能。然而一些回顾性的研究显示长时间麻醉后儿童出现了暂时性的神经后遗症,更多研究证实新生儿手术和麻醉后的长期神经损害。2016年12月14日,美国食品药品监督管理局发布了关于在暴露于用于全身麻醉的某些麻醉剂之后的儿童大脑发育受损的警告,包括吸入麻醉剂异氟醚、七氟醚和地氟醚,以及在妊娠前3个月内的静脉麻醉药丙泊酚和咪达唑仑。人们越来越担心某些麻醉药物对发育期大脑存在影响。此方面人体实验有限,不能确定确切机制。Wnt/β-catenin信号通路是神经细胞生长和增殖的关键调节因子,GSK-3β和β-catenin是Wnt通路的关键分子。Wnt信号对神经元成熟、凋亡、多巴胺能和海马神经发生至关重要。有研究表明发育期大鼠暴露于七氟醚麻醉后,对其学习和记忆能力产生了负面影响;这种影响可能与Wnt/β-catenin信号通路相关。但相关文献较少涉及到信号通道的蛋白表达研究较少。因此本课题拟进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在吸入性麻醉药引起的神经毒性中的具体作用。吸入麻醉药是儿童最常用的全麻药物。我们通过对吸入麻醉药对发育期大脑神经毒性的研究,试图了解Wnt/β-catenin通道在吸入麻醉药神经毒性中的作用机制,并期待找到抑制神经毒性的作用靶点。在满足手术麻醉需要的同时,对儿童选择更合适的吸入性麻醉药及维持浓度和暴露时间,希望儿童获得更安全的麻醉效果和更好的术后转归。我们利用动物实验模型和HT22海马神经元细胞模型观察常用吸入麻醉药对啮齿类动物海马神经元的影响以及学习记忆的影响,以求了解通路机制为临床工作提供理论依据。第一部分利用动物实验模型探讨异氟醚和七氟醚对海马结构中Wnt/β-catenin信号通路的影响目的:建立不同麻醉处理的大鼠模型。对每组大鼠进行不同处理,探讨基于Wnt/β-catenin信号通路,不同吸入性麻醉药对新生大鼠空间学习记忆能力的损伤。方法:1.以出生后第7天的SD雄性大鼠为研究对象,分为5组。对照组:暴露于空气中6小时;异氟醚组（ISA组）:吸入0.75%异氟醚6h;七氟醚组（SEA组）:吸入0.85%七氟醚6h;Wnt抑制剂异氟醚组（ISAI组）:注射Wnt抑制剂后,吸入0.75%异氟醚6h;Wnt抑制剂七氟醚组（SEAI组）:注射Wnt抑制剂后,吸入0.85%七氟醚6h。继续饲养至5周和10周时分别进行实验。2.采用水迷宫实验观察比较各组大鼠的空间学习记忆能力。3.大鼠海马组织切片HE染色,显微镜下观察海马神经元损伤情况。4.实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测Wnt3a、β-catenin和GSK-3 β的mRNA表达水平。5.Western Blot 检测 Wnt3a、β-catenin 和 GSK-3 β 蛋白表达水平。结果:1.水迷宫实验表明异氟醚和七氟醚对P7大鼠的学习记忆能力有损害,随着时间的推移学习记忆能力会逐渐恢复。麻醉前给大鼠注射Wnt抑制剂XAV 939,可减轻脑认知功能损伤（p＜0.05）。2.组织病理学实验显示异氟醚和七氟醚处理组麻醉后5周神经元细胞萎缩,神经元丢失,损伤广泛。Wnt抑制剂可明显减轻其对P7大鼠的神经元损伤。并且这些形态学改变在10周时有明显改善。3.qRT-PCR结果显示吸入麻醉药后5周时Wnt3a和β-catenin的mRNA表达水平显著升高,GSK-3 β的mRNA表达水平显著降低（p＜0.01）。与ISA组和SEA组相比,Wnt抑制剂处理组Wnt3a和β-catenin的mRNA表达水平显著降低,而GSK-3 β mRNA表达水平显著升高（p＜0.05）。10周时,ISA组和SEA组Wnt3a和β-catenin mRNA表达活跃,但较5周时表达降低（p＜0.01）,而Wnt抑制剂处理组基本恢复正常表达水平。4.Western Blot检测显示麻醉后5周ISA和SEA组Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平明显升高,GSK-3 β蛋白表达水平显著降低（p＜0.01）。与ISA、SEA组相比,Wnt抑制剂组在5周时明显抑制海马组织中Wnt3a和β-catenin的上调,而增加 GSK-3 β 的表达（p＜0.05）。10 周后,ISA 组和 SEA 组 Wnt3a 和 β-catenin也明显上调,GSK-3 β显著低于对照组,但与5周时相比上调和表达程度明显降低。结论:1.发育期啮齿类动物大脑接触异氟醚和七氟醚会导致海马神经元细胞凋亡,造成学习和记忆障碍,Wnt信号通路在此过程中发挥重要作用。2.发育期啮齿类动物大脑接触异氟醚和七氟醚导致的学习和记忆障碍是可逆性的,随着时间的推移会基本恢复正常。第二部分利用HT22海马神经元细胞探讨异氟醚和七氟醚对海马神经元中Wnt/β-caten i n信号通路的影响目的:本研究以HT22海马神经元细胞为实验对象,对每组神经元细胞进行不同处理,探讨基于Wnt/β-catenin信号通路,不同吸入性麻醉药对体外海马神经元细胞的损伤情况。方法:本研究以HT22海马神经元细胞为实验对象,分为对照组、异氟醚组（ISA组）、七氟醚组（SEA组）、Wnt抑制剂异氟醚组（ISAI组）、Wnt抑制剂七氟醚组（SEAI组）。1.TUNEL染色检测HT22海马神经元细胞凋亡情况.2.Hoechst33342/PI双染法检测HT22海马神经元细胞凋亡和坏死。3.采用流式细胞分析技术检测HT22海马神经元凋亡率。4.qRT-PCR检测Wnt3a、β-catenin和GSK-3 β 的mRNA表达水平。5.Western Blot检测Wnt3a、β-catenin和GSK-3 β 的蛋白表达水平。结果:1.TUNEL染色检测HT22海马神经元细胞凋亡:异氟醚和七氟醚组凋亡的神经元细胞明显增多（p＜0.01）,且异氟醚组比七氟醚组更明显（p＜0.05）。而加Wnt抑制剂组比ISA组和SEA组神经元凋亡减轻（p＜0.01）。2.Hoechst33342/PI双染法检测HT22海马神经元细胞凋亡和坏死:异氟醚和七氟醚组神经元晚期凋亡和坏死较对照组显著增多（p＜0.01）,且异氟醚组较七氟醚组更严重（p＜0.05）。而加Wnt抑制剂组比ISA组和SEA组神经元坏死减轻（p＜0.01）。3.流式细胞分析技术检测HT22海马神经元凋亡率:异氟醚和七氟醚暴露后,HT22海马神经元凋亡率增高（p＜0.01）,且异氟醚组高于七氟醚组（p＜0.05）,提示异氟醚比七氟醚对神经元的损伤更明显。Wnt抑制剂组细胞凋亡较ISA组和SEA组减轻（p＜0.01）,说明Wnt抑制剂对神经元凋亡有改善作用,提示Wnt信号通路在吸入性麻醉剂引起的神经损伤中发挥重要作用。4.qRT-PCR检测Wnt3a、β-catenin和GSK-3 β 的mRNA表达水平:ISA、SEA组Wnt3a和β-catenin的mRNA表达水平显著升高,而GSK-3 β的mRNA表达水平显著降低（p＜0.01）。ISA组Wnt3a和 β-catenin的mRNA表达水平高于SEA组,而GSK-3β的表达水平低于SEA组（p＜0.05）。加Wnt抑制剂组与ISA组和SEA组相比,Wnt3a和β-cateninmRNA表达水平显著降低,而GSK-3 β表达水平显著升高（p＜0.01）。5.Western Blot检测Wnt3a、β-catenin和GSK-3 β 蛋白表达水平:ISA组和SEA组Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平较对照组明显升高,而GSK-3 β蛋白表达水平显著降低（p＜0.01）。异氟醚组Wnt3a和β-catenin蛋白的表达水平明显高于七氟醚组,而GSK-3 β的表达水平更低（p＜0.05）。与ISA组和SEA组相比,Wnt抑制剂明显抑制海马组织中Wnt3a和β-catenin蛋白的上调,而增加GSK-3β蛋白的表达（p＜0.01）。结果表明,异氟醚和七氟醚可影响HT22海马神经元细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白,升高Wnt3a和β-catenin蛋白的表达量,降低GSK-3 β蛋白的表达量。且异氟醚对Wnt/β-catenin通路的激活较七氟醚更显著。结论:1.异氟醚和七氟醚可引起HT22海马神经元细胞凋亡和坏死。2.异氟醚对HT22海马神经元细胞的损伤作用较七氟醚更加明显。3.Wnt/β-catenin信号通路在异氟醚和七氟醚诱导的HT22海马神经元细胞损伤中起重要的作用。