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背景和目的口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell cancer,OSCC）简称口腔鳞癌,是最常见的口腔恶性肿瘤,有统计研究指出其占口腔恶性肿瘤的90%。口腔鳞癌的复发率和转移率较高,总体预后较差,是一个严重的全球公共卫生问题。目前对于口腔鳞状细胞癌的治疗多采用以手术治疗、放射治疗及化学药物治疗为主的综合序列治疗。化学药物治疗仍被广泛认为是口腔鳞状细胞癌患者有效的临床治疗手段之一,其中铂类化疗药物一直是研究的热点,具有非常重要的临床意义。奥沙利铂（oxaliplatin）即左旋反式二氨环己烷草酸铂,是第三代铂类化疗药物。研究指出奥沙利铂对多种肿瘤有治疗作用,具有疗效好、副作用小等特点,而其对口腔鳞状细胞癌的治疗效果报道较少。此外,深入探究奥沙利铂抗肿瘤的机制,对实现精准用药、促进抗肿瘤药物研发有积极意义。既往研究报道奥沙利铂可以通过损伤细胞DNA、诱导细胞凋亡、引发细胞周期阻滞等多种途径发挥抗肿瘤作用;亦有学者提出奥沙利铂作为一种烷化剂,还可能有其他的作用机制。特别是近年来,多种细胞死亡新形式不断被发现,为更深入理解奥沙利铂的作用机制提供了新思路。多聚腺苷二磷酸（ADP）核糖聚合酶 1（poly（ADP-ribose）polymerase-1,PARP1）依赖性程序性细胞死亡（Parthanatos）是由PARP1过度活化而导致的细胞死亡,是一种独特的调节性细胞死亡方式,参与了多种生理和病理过程。PARP1是参与DNA修复的重要核酶,轻度活化的PARP1能够修复DNA损伤引起的肿瘤对化疗药物的抵抗。但是,最新的研究发现过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）及烷化剂引起的DNA损伤均能造成PARP1的过度激活,继而引发线粒体相关凋亡诱导因子 1（apoptosis inducing factor mitochondria associated 1,AIFM1/AIF）和巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）的核转移,最终对DNA进行切割,而诱发细胞死亡,这就是Parthanatos的主要机制。研究表明Parthanatos参与了多种烷化剂类化学药物诱导的肿瘤细胞死亡过程,这种新型的细胞死亡方式在肿瘤治疗中引起广泛关注。奥沙利铂是一种水溶性烷化剂,其能否引发Parthanatos尚不清楚。综上,奥沙利铂作为一种重要的铂类化疗药物,其在口腔鳞状细胞癌方面的治疗作用研究相对较少,其在口腔鳞状细胞癌治疗过程中发挥作用的具体分子机制也有待进一步完善。因此,本研究旨在探究奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为的调控作用,明确诱导Parthanatos是否是奥沙利铂抑制口腔鳞状细胞癌的机制之一,并探究其具体信号分子传导途径,为揭示奥沙利铂抗肿瘤作用的新机制及Parthanatos在口腔鳞状细胞癌治疗方面的价值提供理论依据。本实验首先通过裸鼠体内成瘤实验及体外细胞实验,检测了奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌的抑制作用;随后通过多种分子生物学检测方法证实了奥沙利铂诱发了口腔鳞状细胞癌细胞的Parthanatos死亡,且过量活性氧的产生在Parthanatos的启动方面发挥重要作用;最后运用生物信息学分析手段,对Parthanatos关键蛋白PARP1在口腔鳞状细胞癌的表达特点及与临床特征的相关性进行了分析,揭示了 PARP1的调控作用可能存在两面性。本研究从新的视角探讨奥沙利铂在口腔鳞状细胞癌治疗方面的应用潜力与作用机制,期望能为推动口腔鳞状细胞癌的化学药物治疗提供理论基础。材料和方法1.奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响（1）本研究选择口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27和SCC25作为研究对象,CCK-8法检测浓度为0-300 μM的奥沙利铂对CAL27和SCC25两种细胞增殖活性的影响,获得半数抑制浓度IC50。（2）奥沙利铂分别处理CAL27和SCC25两种细胞,检测奥沙利铂对CAL27和SCC25细胞克隆形成能力的影响。（3）奥沙利铂分别处理CAL27和SCC25两种细胞,划痕实验检测奥沙利铂对CAL27和SCC25细胞迁移能力的影响。（4）奥沙利铂分别处理CAL27和SCC25两种细胞,通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放实验检测奥沙利铂对两种细胞的毒性作用,计算细胞死亡率。（5）利用口腔鳞状细胞癌细胞构建裸鼠体内成瘤模型,腹腔注射奥沙利铂或PBS对裸鼠给予治疗,通过测量肿瘤体积、称量肿瘤质量来检测奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌的治疗作用。2.Parthanatos在奥沙利铂诱导的口腔鳞状细胞癌细胞死亡过程中的作用和分子机制研究（1）利用免疫组织化学染色分析口腔鳞状细胞癌裸鼠体内成瘤模型,评价奥沙利铂治疗组与PBS对照组的瘤体组织中Parthanatos关键蛋白PARP1的表达差异。（2）奥沙利铂分别处理CAL27和SCC25两种细胞,利用JC-1探针检测线粒体膜电位,荧光显微镜观察分析单体JC-1/多聚体JC-1的比率。（3）以CCK-8筛选的IC50为依据,用不同浓度的奥沙利铂以不同的作用时间分别处理CAL27和SCC25两种细胞,Western Blot检测Parthanatos相关蛋白PARP1、AIF、MIF等在细胞浆和细胞核内的表达水平;用奥沙利铂分别处理CAL27和SCC25两种细胞后进行AIF免疫荧光染色,荧光显微镜观察及分析AIF的核转移情况。（4）使用PARP1抑制剂Rucaparib预处理CAL27和SCC25细胞,检测其对奥沙利铂诱导的CAL27和SCC25细胞死亡的影响:实验分为对照组、奥沙利铂组、Rucaparib+奥沙利铂组,通过LDH释放实验分析细胞死亡率;Western Blot检测Parthanatos相关蛋白PARP1、AIF、MIF等在细胞浆和细胞核内的表达水平;细胞免疫荧光染色检测AIF的核转移情况。（5）通过siRNA沉默PARP1,检测其对奥沙利铂诱导CAL27和SCC25细胞死亡的影响:分为沉默对照（siNC）组、奥沙利铂处理（siNC+奥沙利铂）组、沉默PARP1+奥沙利铂（siPARP1+奥沙利铂）组,通过LDH释放实验分析细胞死亡率;Western Blot检测Parthanatos相关蛋白PARP1、AIF、MIF等在细胞浆和细胞核内的表达水平;细胞免疫荧光染色检测AIF的核转移情况。（6）奥沙利铂分别处理CAL27和SCC25两种细胞,检测细胞内还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）浓度及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性的变化;设置对照组、奥沙利铂组、抗氧化剂NAC+奥沙利铂组,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平。（7）应用抗氧化剂NAC预处理CAL27和SCC25细胞,检测其对奥沙利铂诱导CAL27和SCC25细胞死亡的影响:实验分为对照组、奥沙利铂组、NAC+奥沙利铂组,通过LDH释放实验分析细胞死亡率;Western Blot检测Parthanatos相关蛋白PARP1、AIF、MIF等在细胞浆和细胞核内的表达水平;细胞免疫荧光染色检测AIF的核转移情况。3.口腔鳞状细胞癌组织Parthanatos关键蛋白PARP1的生物信息学分析（1）通过TCGA公共数据库的口腔鳞状细胞癌组织基因表达数据集,比较口腔鳞状细胞癌组织与正常组织PARP1的表达差异。（2）对PARP1高表达及低表达组的病例进行Kaplan-Meier生存分析,评价PARP1的表达是否与口腔鳞癌患者的预后有相关性。（3）对不同年龄（小于等于60岁,大于60岁）、不同性别（男,女）、不同肿瘤分级（G1,G2,G3）、不同肿瘤分期（Ⅰ期,Ⅱ期,Ⅲ期,Ⅳ期）的样本PARP1的表达差异进行分析。（4）对PARP1高表达及低表达组样本进行细胞增殖、细胞周期、凋亡等相关基因表达差异分析。（5）利用GSVA分析方法对PARP1高表达及低表达组样本的Hallmark、KEGG基因集富集情况进行分析比较。结果1.奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为的调控作用（1）CCK-8结果显示奥沙利铂对CAL27和SCC25两种细胞的细胞活性有抑制作用,且抑制作用随着药物浓度的增加、作用时间的延长而增强;奥沙利铂对CAL27和SCC25两种细胞24小时半数抑制浓度IC50分别为125μM和100μM。（2）在奥沙利铂的作用下,CAL27和SCC25两种细胞的克隆数量随着奥沙利铂药物浓度的增加（CAL27:0μM、31.25 μM、62.5 μM、125 μM;SCC25:0μM、25μM、50 μM、100μM）而减少,即奥沙利铂抑制了 CAL27 和 SCC25的克隆形成能力。（3）奥沙利铂对CAL27和SCC25两种细胞的迁移能力有抑制作用,且抑制作用随奥沙利铂浓度升高而增强（CAL27:0 μM、31.25 μM、62.5 μM、125μM;SCC25:0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）。（4）LDH释放实验结果显示:分别用125μM、100μM奥沙利铂处理CAL27和SCC25两种细胞会造成显著的细胞死亡,且随作用时间延长（0小时、12小时、24小时、48小时）,细胞死亡率越高。（5）口腔鳞状细胞癌裸鼠体内成瘤实验结果显示:奥沙利铂治疗后瘤体平均体积、平均质量明显低于PBS对照组,证实奥沙利铂抑制了口腔鳞状细胞癌的发展。2.Parthanatos在奥沙利铂诱导的口腔鳞状细胞癌细胞死亡过程中的作用和分子机制研究（1）口腔鳞状细胞癌裸鼠体内成瘤模型的免疫组织化学染色结果显示奥沙利铂治疗组PARP1的表达水平显著高于PBS对照组。（2）分别用125 μM、100μM奥沙利铂处理CAL27和SCC25两种细胞后,与空白对照组相比,单体JC-1/多聚体JC-1的比率显著升高,表明奥沙利铂造成了线粒体膜电位的去极化。（3）Western Blot检测结果显示:在不同浓度（CAL27:0 μM、31.25 μM、62.5 μM、125 μM;SCC25:0μM、25 μM、50 μM、100 μM）的奥沙利铂处理CAL27和SCC25两种细胞不同时间（0小时、12小时、24小时、48小时）后,与对照组相比,Parthanatos相关蛋白PARP1、AIF、MIF在细胞核表达升高;AIF的免疫荧光染色结果显示奥沙利铂处理后CAL27和SCC25两种细胞发生AIF的核转移。（4）应用PARP1抑制剂Rucaparib预处理后,LDH释放实验结果显示Rucaparib+奥沙利铂组比奥沙利铂组的细胞死亡率明显降低;Western Blot检测结果显示Rucaparib+奥沙利铂组的PARP1、AIF、MIF在细胞核内的表达水平比奥沙利铂组明显降低;免疫荧光染色结果显示Rucaparib+奥沙利铂组比奥沙利铂组细胞AIF核转移水平明显下降。（5）奥沙利铂处理转染了 siPARP1的CAL27和SCC25细胞后,LDH检测结果显示siPARPl+奥沙利铂组比siNC+奥沙利铂组细胞死亡率显著降低;Western Blot检测结果显示siPARP1+奥沙利铂组比siNC+奥沙利铂组的PARP1、AIF、MIF在细胞核内的表达水平明显下降;细胞免疫荧光检测结果显示siPARP1+奥沙利铂组的AIF核转移水平比siNC+奥沙利铂组明显降低。（6）与对照组相比,奥沙利铂处理后CAL27和SCC25细胞GSH浓度下降、SOD活性降低;DCFH-DA探针检测显示奥沙利铂组比对照组的ROS水平升高,而NAC+奥沙利铂组比奥沙利铂组的ROS水平降低。（7）使用抗氧化剂NAC预处理CAL27和SCC25两种细胞后,LDH释放实验结果显示NAC+奥沙利铂组细胞死亡率低于奥沙利铂组;Western Blot检测结果显示NAC+奥沙利铂组PARP1、AIF、MIF在细胞核内的表达水平低于奥沙利铂组;细胞免疫荧光检测结果显示NAC+奥沙利铂组AIF的核转移水平低于奥沙利铂组。3.口腔鳞状细胞癌组织Parthanatos关键蛋白PARP1的生物信息学分析（1）口腔鳞状细胞癌组织的PARP1表达水平高于正常组织。（2）与PARP1低表达组相比,PARP1高表达组患者的生存率较低,生存时间较短、预后较差。（3）口腔鳞状细胞癌分期及分级与PARP1的表达有相关性,即肿瘤分级越高,PARP1表达水平越高;肿瘤分期越接近晚期,PARP1表达水平越高。（4）PARP1高表达组口腔鳞状细胞癌组织中与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡相关基因的表达水平高于PARP1低表达组。（5）GSVA分析结果显示PARPI高表达组口腔鳞状细胞癌的增殖评分明显高于低表达组,表明PARP1是OSCC细胞增殖的阳性调节因子。结论1.奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为有显著影响,在体外可以抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移,促进细胞死亡;在体内抑制瘤体组织的生长。2.奥沙利铂能够引起口腔鳞状细胞癌细胞PARP1的过度激活、线粒体膜电位降低、AIF的核转移,促进细胞发生PARP1依赖的Parthanatos死亡,而奥沙利铂引发的Parthanatos可能是ROS的过量产生导致的。3.口腔鳞状细胞癌组织中Parthanatos关键蛋白PARP1的表达水平高于正常组织,且PARP1的表达水平越高患者预后越差;PARP1对口腔鳞状细胞癌的调控可能有两面性。