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维生素D3（Vitamin D3）作为一种重要的类固醇衍生物对机体的代谢起着关键作用,目前有关脊椎动物的研究主要集中在维生素D3对机体钙磷稳态、骨骼矿化、肌肉功能、脂质代谢以及免疫力等生理功能的影响。而在无脊椎动物的研究主要聚焦在经济甲壳类需求量的探讨,其中有些研究由于年代久远,评价指标不完善,导致所取得的适宜需求量差别较大,不足以支撑对维生素D3生理功能的系统性深入研究。类似于脊椎动物的骨骼矿化过程,蜕壳作为标志性的生物学现象贯穿甲壳动物整个生长发育的周期。然而,作为我国主要的经济甲壳类动物中华绒螯蟹,在养殖生产中常出现蜕壳不遂,个体规格偏小,以及蜕壳后感染细菌病等现象,这不仅影响到个体的存活和生长,也直接影响到养殖产量和效益的提高。鉴于此,如何通过营养学的手段强化蟹种的体质、抗逆性和抗感染力,保证蟹的正常生长和蜕壳,从而适应多样化的养殖环境条件,有效提高养殖产量和效益,是目前中华绒螯蟹养殖业面临的一个重要问题。本论文选择维生素D3为研究对象,通过营养学、分子生物学、免疫学及转录组学分析等研究方法,分别探讨了维生素D3对中华绒螯蟹不同生长阶段的生长性能、蜕壳频率和免疫力的影响和作用,并研究在不同营养条件下,维生素D3与钙、维生素D3与脂肪的交互作用对幼蟹生理功能的影响。取得的主要结果及结论如下:1.维生素D3对仔蟹生理功能的影响为了探究维生素D3对中华绒螯蟹仔蟹的生长性能、抗氧化能力、免疫力和蜕壳的影响,选用6000只大眼幼体（7.52±0.10 mg）,分别饲喂6种含不同水平维生素D3（0、3000、6000、9000、12000和36000 IU/kg）的等氮等脂饲料23天。结果表明,饲喂6000 IU/kg维生素D3的仔蟹存活率和蜕壳频率最高。饲喂3000和6000 IU/kg维生素D3的仔蟹增重率、特定生长率和甲壳增长率与未添加维生素D3的对照相比显著增加。基于蜕壳频率、增重率和特定生长率的折线模型的分析,表明仔蟹饲料中维生素D3需求量最适范围为4825-5918 IU/kg。12000IU/kg维生素D3组的仔蟹全蟹维生素D3含量最高,25-二羟基维生素D3含量随着饲料中维生素D3的增加而降低。各维生素D3添加组的仔蟹丙二醛含量均显著低于对照组。此外,饲喂6000 IU/kg维生素D3的仔蟹超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力显著高于对照组。9000 IU/kg维生素D3组的仔蟹在120 h盐胁迫试验后的存活率最高。基因表达的结果表明,维生素D受体（VDR）可能是仔蟹正常蜕壳和先天免疫相关基因的重要调控元件。分析盐度胁迫前后蜕壳相关基因表达的结果,仔蟹可通过下调蜕壳相关基因的表达,来降低蜕壳频率以减少盐度胁迫对仔蟹存活率的影响。综上,适量的维生素D3能够有效改善中华绒螯蟹仔蟹的生长性能,保障机体正常的蜕壳活动,提高先天免疫能力及抗氧化能力,同时增强了仔蟹的抗盐度胁迫能力。2.维生素D3代谢物与VDR对幼蟹的生长、蜕壳及其免疫力的调控作用维生素D3对高等动物生理功能的影响和调控已有相关报道,然而维生素D3及其代谢物究竟是如何调控中华绒螯蟹生理功能的,迄今尚无详细的研究。本研究设计6个维生素D3水平的等氮等脂纯化日粮饲喂幼蟹（0.29±0.01 g）56天。基于增重率、特定生长率和蜕壳频率的拟合模型表明,幼蟹饲料中最适宜维生素D3添加水平为5685.43-10000 IU/kg。其中,饲喂9000 IU/kg维生素D3的幼蟹表现出最佳的生长性能。添加9000 IU/kg维生素D3能够显著增加幼蟹肝胰腺和肠道的抗氧化能力,RT-q PCR结果也表明该剂量能够最大限度上调幼蟹蜕壳相关基因（甲壳动物高血糖激素、蜕皮激素受体、维甲酸受体等）和先天免疫相关基因（Toll样受体、髓样分化因子88、溶菌酶等）的表达量。肝胰腺转录组分析结果表明,维生素D3可以显著影响内质网中的蛋白质加工、类固醇生物合成以及抗原加工和呈递三条信号通路。酶联免疫吸附试验结果表明,适量的维生素D3可以提高维生素D受体、维甲酸X受体和C型凝集素的蛋白浓度。同时发现,饲喂3000-9000 IU/kg维生素D3的幼蟹血清中1α,25-二羟基维生素D3含量显著升高。为了验证1α,25-二羟基维生素D3及VDR基因对幼蟹生理功能的调控作用,通过si RNA预实验结果获知,VDR基因在肝胰腺中的表达水平最高,对VDR基因抑制效率最优的两个靶点分别为si RNA-74（76.62%）和si RNA-200（65.49%）,最佳注射浓度和注射频率为2μg/g体重,注射间隔时间是36小时。在最优条件下采用si RNA-74和si RNA-200两个靶点以及骨化三醇（Calcitriol）进行1α,25-二羟基维生素D3与VDR基因关系的验证,结果显示,si RNA组显著抑制VDR基因表达,Calcitriol组显著提高VDR基因表达,si RNA+Calcitriol组可以上调VDR基因水平,但仍然低于NC组（对照组）。综上,饲料中适量的维生素D3能够通过提高1α,25-二羟基维生素D3含量,以及特异性上调VDR基因的表达,来促进中华绒螯蟹幼蟹的生长和蜕壳,提高机体的抗氧化能力和先天免疫力,但饲料中过量的维生素D3反而会产生负面的抑制效果。3.不同饲料钙水平下维生素D3对幼蟹蜕壳生长、钙磷沉积和先天免疫的影响在脊椎动物研究中膳食钙水平已被证明会通过影响维生素D3,来抑制影响肠道对钙磷的吸收,并进一步影响机体的骨骼矿化过程。为了评估饲料钙和维生素D3的可能协同作用对中华绒螯蟹幼蟹的蜕壳生长、钙磷沉积和先天免疫的影响,配制了6种等氮等脂饲料:两个Ca水平（0%和1.5%,缩写D和N）和三个维生素D3水平（0、9000和27000 IU/kg,缩写LVD、MVD和HVD）饲喂幼蟹（3.20±0.01 g）56天。结果表明,饲料钙和维生素D3的交互作用对幼蟹的增重率,特定生长率,灰分含量以及血清-1α,25-二羟基维生素D3含量均有显著性影响,其中N+MVD（1.5%Ca+9000 IU/kg维生素D3）组的幼蟹具有最低的饲料系数,同时增重率、特定生长率、蜕壳频率、血清-1α,25-二羟基维生素D3浓度最高。分析钙磷代谢指标发现,饲料钙和维生素D3的交互作用对肌肉钙磷沉积、血淋巴钙磷代谢指标（血钙、血磷、降钙素等）也具有显著性的影响。此外,钙和维生素D3的交互作用显著影响幼蟹的丙二醛含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力,同时也显著影响VDR基因、蜕壳相关基因（甲壳动物高血糖激素、蜕皮激素受体、维甲酸受体等）和先天免疫相关基因（Toll样受体、髓样分化因子88、溶菌酶等）的表达;饲料中不添加钙显著降低幼蟹增重率、蜕壳频率和胰蛋白酶活性,导致肝胰腺和肌肉中钙磷含量降低,同时还下调了蜕壳相关基因和免疫相关基因的表达水平。与N+HVD（1.5%Ca+27000IU/kg维生素D3）组相比,D+HVD（0%Ca+27000 IU/kg维生素D3）组幼蟹的增重率、特定生长率、胰蛋白酶活性、蜕壳相关基因（甲壳动物高血糖激素、几丁质酶、蜕皮激素受体、维甲酸X受体）表达量和先天免疫相关基因（Toll样受体2、溶菌酶、抗脂多糖因子、围食膜因子-44样蛋白、围食膜因子）的m RNA水平均显著降低。综上,饲料中添加适当的钙和维生素D3可促进中华绒螯蟹幼蟹的蜕壳和生长,提高机体的抗氧化能力和先天免疫力,而饲料中缺乏钙且补充过量的维生素D3则会带来负面影响。4.不同饲料脂肪水平下维生素D3对幼蟹抗氧化能力、脂质代谢和先天免疫力的影响维生素D3作为脂溶性维生素不仅需要依靠脂肪发挥其生物学功能,同时也影响机体的脂肪代谢过程。为了评估饲料脂肪和维生素D3的可能协同作用对幼蟹的生长、蜕壳、脂质代谢和免疫力的影响,本研究配制6种等氮饲料:两个脂肪水平（1.5%和7.5%,缩写LL和NL）和三个维生素D3水平（0、9000和27000IU/kg,缩写LVD、MVD和HVD）饲喂幼蟹（5.83±0.01 g）56天。试验结果表明,饲料脂肪和维生素D3水平的协同作用对生长性能（增重率、特定生长率和蜕壳频率）无显著影响,但是对灰分、总蛋白、肝胰腺脂肪含量以及血清1α,25-二羟基维生素D3含量具有显著的影响。脂肪代谢指标的分析结果,饲料脂肪和维生素D3水平的交互对总胆固醇含量和低密度脂蛋白胆固醇含量有显著的影响,同时也显著影响肝胰腺脂肪分解和合成基因的表达水平。饲喂正常脂肪水平（7.5%）和9000 IU/kg维生素D3能够提高幼蟹肝胰腺指数、血清1α,25-二羟基维生素D3含量、肝胰腺抗氧化能力,并上调蜕壳相关基因和先天免疫相关基因的表达。同时,两者的协同作用显著提高了脂肪合成基因m RNA水平,下调脂肪分解基因m RNA水平。而当饲料中脂肪水平偏低（1.5%）时,幼蟹的增重率、特定生长率和蜕壳频率降低,血清1α,25-二羟基维生素D3含量下降,同时还会上调脂肪分解基因表达水平,下调脂肪合成基因表达水平;与此同时,该处理组也同时降低了机体的抗氧化能力和先天免疫能力。此外,低脂饲料中伴随缺乏或者过量添加维生素D3,均会导致幼蟹体灰分和蛋白沉积量减少,蜕壳频率下降,降低机体抗氧化能力的同时,还将会影响抗菌肽的产生以及带来脂肪的异常沉积。综上,饲料中适当的脂肪水平（7.5%）以及添加适量维生素D3（9000 IU/kg）,能够提高中华绒螯蟹幼蟹的抗氧化能力,维持正常脂肪代谢和提高先天免疫能力。而低脂饲料不仅会抑制幼蟹的生长,同时也会造成脂肪代谢紊乱,降低机体的抗氧化能力和先天免疫力。