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背景：
高血压是一种由多种病因相互作用所致、进行性复杂心血管综合征,也是是心脑血管病发生的最重要危险因素之一,同时还可造成多个靶器官损伤,病残率和死亡率较高。血压增高时心脏的后负荷增加、血流动力学改变、左心室肥厚以及心腔扩大,可导致心肌纤维化。心肌纤维化形成是缓慢的动态过程,涉及细胞、细胞因子、细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)等多因素、多环节的相互作用和相互调节的复杂过程。心肌纤维化过程中,激活相应的免疫机制,使T淋巴细胞及巨噬细胞等细胞活化,产生和释放多种活性因子,激活心肌的细胞外基质生成细胞,使胶原形成及代谢异常,并可导致心肌实质细胞的变性、坏死或亚细胞结构变化等,从而引起一系列病理生理变化,但目前心肌纤维化的发生机制尚不清楚。
目前国际社会对高血压的认识已经发生根本性转变,认为高血压不仅仅与炎症相关,而且具备了炎症的特征,是一种低度炎症反应。炎症在高血压的发生、发展以及对靶器官的损害中起重要作用,而高血压通过其血流生物力学刺激又可促进炎性反应。越来越多的证据表明,以炎症细胞浸润为特征的的血管炎症是高血压进展的重要机制。
传统观点认为,循环和组织中白细胞及单核-巨噬细胞参与了心血管疾病中炎症发生的重要过程。但新近的观点认为,T淋巴细胞亚型也参与高血压炎症的过程。也有研究显示,T淋巴细胞亚型在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致高血压和血管炎症过程中发挥重要作用,其中重要的亚群为CD8+T淋巴细胞,主要参与获得性免疫反应病毒清除的过程。目前研究发现在病毒诱导的肾炎及慢性阻塞性肺疾病模型中,CD8+T淋巴细胞通过分泌细胞因子及趋化因子招募并活化巨噬细胞;肥胖脂肪组织中CD8+T淋巴细胞能够影响巨噬细胞,调节炎症级联反应。然而,CD8+T淋巴细胞在心肌纤维化过程中功能及作用尚不清楚。因此,我们假设,在心肌组织纤维化发展过程中,CD8+T淋巴细胞通过趋化巨噬细胞,粘附血管壁并迁移进入心肌组织,同时促使胶原沉积,平滑肌增生,最终导致纤维化。
目的：
通过血管紧张素Ⅱ灌注制备小鼠高血压模型,采用病理学,分子生物学及流式细胞学分析技术检测心脏组织中胶原沉积、炎症细胞浸润及炎症因子表达,探讨CD8+T淋巴细胞在高血压心脏炎症反应和纤维化过程中的生物学特性,明确高血压状态下,CD8+T淋巴细胞激活巨噬细胞的原因及类型,炎症细胞作用对心脏纤维化形成的贡献,试图阐明高血压通过炎症细胞导致心肌纤维化的分子机制,为临床预防高血压靶器官早期损伤提供干预靶点及科学依据。
方法：
1.研究对象分组:将野生型小鼠及CD8敲除小鼠分为4组:醋酸生理盐水溶液灌注组(假处理组);血管紧张素Ⅱ灌注组(处理组);醋酸生理盐水溶液灌注+CD8敲除组;血管紧张素Ⅱ灌注+CD8敲除组。MCP-1敲除小鼠,CD4敲除鼠,OT-1转基因鼠,IL-6敲除鼠,IFN-V敲除鼠分组同上。
2.小鼠高血压模型制备:采用血管紧张素Ⅱ微量泵(1500ng/kg*min)灌注模拟高血压致心脏纤维化模型。
3.血压测量:采用尾套管血压仪连续测定实验小鼠尾动脉血压。
4.心脏功能测定:采用小动物超声心动仪测定小鼠心脏功能。
5.心脏组织纤维化测定:采用Masson三色特殊染色方法检测组织内胶原沉积。采用免疫组织化学染色及WesternBlot(W.B.)方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子-β(TGF-β)的表达。
6.心脏组织炎症细胞及炎症因子测定:采用免疫组织化学染色及逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)方法检测巨噬细胞特异性标记巨噬细胞半乳糖特异性凝集素-2(Mac2),以及炎症因子白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)。
7.炎症细胞标记检测:采用流式细胞法测定炎症细胞CD206+CD11C+表达。
8.细胞培养及处理:分离并培养小鼠腹腔巨噬细胞及淋巴组织C炎症细胞标记检测:采用流式细胞法测定炎症细胞CD206+CD11C+表达。CD8+Tcell进行实验,采用transwell体系检测CD8+Tcell与巨噬细胞发生作用机制。
9.细胞迁移测定:采用Transwell小室测定细胞趋化迁移活性
10.细胞因子测定:采用CBA法测定体外细胞共培养上清中细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ及MCP-1的表达。
11.阻断MCP-1检测:MCP-1治疗观察体内抑制MCP-1水平心脏纤维化表达变化。
12.统计学分析:所有数据都以平均值±标准差表示。组间均数比较采用one-way完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA):P＜0.05认为差异有统计学意义。
结果：
1.与醋酸盐溶液灌注相比,血管紧张素Ⅱ灌注一周,明显增加野生型小鼠动脉血压(p＜0.001)。
2.动脉血压升高促进心脏组织中炎症细胞及淋巴细胞浸润。AngⅡ灌注促进促进心脏组织中CD45+细胞、T细胞及CD206+巨噬细胞表达增加。
3.血管紧张素Ⅱ灌注诱导的心脏纤维化形成不依赖于CD4+T淋巴细胞的作用。AngⅡ灌注促进CD4+T及CD8+T淋巴细胞在心脏组织中浸润增加,然而CD4敲除小鼠与野生小鼠相比,心脏纤维化程度、胶原形成及TGF-β、α-SMA表达无显著性差异。
4.CD8+T淋巴细胞可加重血管紧张素Ⅱ灌注导致的心脏组织炎症细胞浸润及胶原沉积。CD8敲除减轻AngⅡ诱导的心脏纤维化,静脉回输CD8+T淋巴细胞,CD8敲除小鼠心脏纤维化加重。
5.促纤维化巨噬细胞的浸润与活化依赖于CD8+T淋巴细胞。
6.CD8+T淋巴细胞与巨噬细胞相互作用促进巨噬细胞分泌MCP-1。CD8+T淋巴细胞与巨噬细胞通过细胞细胞接触促进MCP-1表达增加,同时,促进炎症级联反应增强,且MCP-1的主要来源为巨噬细胞。
7.CD8+T淋巴细胞活化巨噬细胞呈现细胞-细胞接触方式,该过程不依赖于T细胞受体(TCR)。体外培养OT-1鼠CD8+T淋巴细胞与巨噬细胞,与野生小鼠CD8+T淋巴细胞与巨噬细胞比较,炎症因子表达及趋化因子MCP-1表达无显著性差异。
8.抑制循环中MCP-1水平改善血管紧张素Ⅱ诱导的高血压心脏纤维化及炎症反应。MCP-1敲除鼠静脉回输野生巨噬细胞,心脏炎症及纤维化程度加重,中和循环中MCP-1,抑制心脏炎症反应及TGF-β、α-SMA表达。
9.血管紧张素Ⅱ诱导的高血压促进心肌组织中巨噬细胞分化为2型巨噬细胞。
结论：
1.血管紧张素Ⅱ诱导循环血压升高,促进炎症细胞在心脏组织中浸润。
2.CD8+T淋巴细胞可加重血管紧张素ll灌注导致的心脏组织炎症细胞浸润及胶原沉积。
3.促纤维化巨噬细胞的浸润与活化依赖于CD8+T淋巴细胞。
4.CD8+T淋巴细胞与巨噬细胞呈现细胞-细胞接触方式,其过程不依赖于TCR。
5.体内抑制MCP-1水平改善高血压心脏纤维化。
综上所述,炎症是血管紧张素Ⅱ导致心脏纤维化的重要机理,其中CD8+T淋巴细胞通过与巨噬细胞之间相互作用放大炎症反应,并通过产生趋化因子MCP-1招募循环中更多炎症细胞浸润,进一步明确多种炎症因子共同参与胶原沉积及纤维化形成损伤过程,控制循环血压以及降低机体MCP-1水平可能成为临床治疗心脏纤维化疾病的有效措施。CD8+T淋巴细胞对高血压心脏损伤的影响,揭示免疫细胞在高血压导致心脏炎症和纤维化的分子机理,明确CD8+T淋巴细胞在高血压炎症及纤维化中的作用,揭示高血压导致心脏纤维化的病理过程及其机制,为临床控制和抑制压力负荷下心脏炎症反应提高依据。