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目的:通过观察uPA纤溶途径在酒精性肝纤维化中的动态变化及清肝活血方对其影响,探讨uPA纤溶途径在酒精性肝纤维化中的作用及清肝活血方调控机制。
方法：
1.雄性SD大鼠随机分为空白组,四氯化碳(CCl4)组和模型组。模型组采用56°二锅头酒、玉米油、吡唑混合物灌胃,1次/天,第2周起腹腔注射CCl4橄榄油溶液,2次/周。CCl4组腹腔注射同模型组,以与模型组相同体积生理盐水灌胃。8周后模型组随机分为模型对照组,清肝活血方组、清肝方组及活血方组。各治疗组分别加用相应药物灌胃,其它各组加用等体积生理盐水灌胃。在4、8、10周分别处死8只大鼠行动态观察,12周末处死其余大鼠.观察大鼠肝功能变化、肝组织病理学改变,用Western-Blot、Real-TimePCR、免疫荧光法检测uPA、PAI-1、MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达。
2.构建pSilencer-PAI-1质粒,沉默PAI-1基因,以正常HSC-T6为对照,通过MTT实验确定乙醛刺激HSC-T6细胞及PAI-1-/-HSC-T6细胞增殖模型的最佳浓度,并且确定清肝活血方有效成份丹参素、葛根素、黄芩黄酮及柴胡皂苷对HSC-T6及PAI-1-/-HSC-T6细胞的安全范围。再用流式细胞仪技术检测清肝活血方有效成份对乙醛刺激HSC-T6细胞及PAI-1-/-HSC-T6细胞活化与增殖的影响。Real-Time PCR检测清肝活血方有效成份对乙醛刺激HSC-T6细胞及PAI-1-/-HSC-T6细胞PAI-1、uPA、MMP-2以及TGF-β1表达的影响。
结果：
1.与空白组比较,CCl4组无显著性差异;模型组肝纤维化程度明显加重(P＜0.01),血清ALT、AST水平明显升高(P＜0.05);uPA及PAI-1水平明显升高,且PAI-1升高幅度高于uPA(P＜0.01);MMP-2、MMP-9及TIMP-1水平明显升高(P＜0.01),且TIMP-1升高幅度高于MMP-2和MMP-9(Real-Time PCR检测)。与模型对照组比较,清肝活血方及其拆方均能不同程度地减轻酒精性肝纤维化大鼠肝纤维化程度(P＜0.01),降低血清ALT、AST水平,显著降低PAI-1及TIMP-1表达,提高uPA、MMP-2及MMP-9表达,全方对上述环节的调控优于拆方。
2.单独用乙醛刺激HSC-T6细胞,对HSC-T6细胞周期影响不大;黄芩黄酮和葛根素则可以将乙醛刺激HSC-T6细胞阻滞在G2/M期;而柴胡皂苷和丹参素则可以将乙醛刺激HSC-T6细胞阻滞在S期。在HSC中加入乙醛后,PAI并TGF-β1基因表达量较空白组明显上升,而uPA和MMP-2表达量下降。丹参素和黄芩黄酮可以逆转uPA和MMP-2下降。丹参素可以明显下调因乙醛造成HSC-T6细胞PAI-1基因的上升。黄芩黄酮则显著降低了TGF-β1的表达,柴胡皂苷和葛根素效果不明显。RNAi作用后,细胞周期发生了变化,主要表现是G1期明显增加,G2期和S期明显减少。pSi-PAI RNAi质粒能显著抑制靶基因PAI-1表达,使其表达量下降10倍左右,TGF-β1基因表达量下降0.5倍左右。而uPA和MMP-2表达量在干扰后变化不是很明显。丹参素和黄芩黄酮可以逆转uPA和MMP-2下降。其中,丹参素可以明显下调因乙醛造成HSC-T6细胞PAI-1基因的上升。黄芩黄酮则显著降低了TGF-β1的表达,柴胡皂苷和葛根素效果不明显。
结论：
1.uPA迁溶途径在ALF中具有重要作用,随着ALF的形成,uPA、MMP-2、MMP-9、PAI-1、TIMP-1均明显升高,但以PAI-1及TIMP-1升高幅度更大。
2.清肝活血方及其拆方均能改善ALF大鼠肝功能,减轻纤维化程度,全方作用优于拆方,其机制可能与通过调控uPA纤溶途径有关。
3.清肝活血方有效成份可在不同时间点影响HSC的细胞周期,丹参素和黄芩黄酮对ECM的生成与降解有显著影响。