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野生稻是栽培稻的祖先,其长期处于野生状态,经受各种灾害和恶劣环境的选择,具有各种抗性和耐不良环境的优良特性,如耐病、耐寒、耐阴、耐旱、耐淹、耐盐碱、胞质雄性不育等,这些优良性状是栽培稻遗传改良的重要物质基础。云南省拥有三种野生稻:普通野生稻(Oryza.rufipogon)、药用野生稻(Oryza.officinalis)、疣粒野生稻(Otyza.granulata)。有研究曾对云南野生稻进行稻瘟病抗性的鉴定,发现云南元江普通野生稻不抗稻瘟病,景洪普通野生稻大部分抗不同病害。本研究组曾在2001-2002年用8个代表性稻瘟病菌株对景洪直立型普通野生稻进行稻瘟病鉴定,表明景洪直立型普通野生稻高抗稻瘟病。
为了研究景洪直立型普通野生稻抗稻瘟病的原因,我们参考已报道的栽培稻抗稻瘟病Pi-ta基因序列(AF207842和AK066558)为参考,合成三对引物,用PCR法分段扩增景洪直立型紫杆普通野生稻抗稻瘟病Pi-ta基因,结果获得Pi-ta基因的4672 bp序列,该序列包含完整的编码框、内含子和终止密码子下游的331 bp。序列分析发现:景洪直立普通野生稻Pi-ta基因与栽培稻社糯(Yashiro-mochi)的同源性为99.86%,共有4个核苷酸的差异,并导致3个氨基酸残基的改变:但在Pi-ta基因编码蛋白的918关键位点,两者都是丙氨酸,故景洪直立紫杆普通野生稻.Pi-ta基因属于抗病的Pi-ta+等位基因。对景洪直立紫杆普通野生稻Pt-ta+等位基因推导的氨基酸残基二级结构进行预测。发现景洪直立紫杆普通野生稻与栽培稻社糯PITA蛋白二级结构完全相同。但是两者在编码区核苷酸的差异,并导致3个氨基酸残基的改变,在这3个改变的氨基酸残基中有两个(第222位和641位)是由非极性的R基氨基酸突变成不带电荷的极性氨基酸。为了明确这种改变是否影响其蛋白的理化性质及功能改变,并最终在对稻瘟病抗菌谱和抗性的大小上产生差异。我们构建了Pi-ta+等位基因包含内含子的高表达载体pCAMBIAl301-121/Pita和针对Pi-ta基因的RNA干涉载体pDS1301/RNAi,以此来分析景洪直立紫杆普通野生稻Pi-ta+等位基因是否与社糯的抗病性和抗菌谱存在差异,以期为作物遗传改良提供抗源基础。
目前鲜有云粳优15品种和合系35作为受体的遗传转化报道,我们对其进行组培试验。发现合系35和云粳优15在MS+2.5mg/L2,4-D+0.4mg/LKT的愈伤诱导培养基都能很好的产生愈伤,比较了MS、N6、NB三种基本培养基,发现在激素浓度一定的情况下(2.5 mg/L KT+0.5 mg/LNAA)NB培养基更有利于分化。用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化法,将构建的pDS1301/RNAi载体进行遗传转化,最终我们得到了33株农杆菌侵染的合系35(9株)和云粳优15(24株)材料,在这些材料中,有一株云粳优15在表型上生长发育迟缓。
我们用合成的另外三对引物在景洪直立绿杆普通野生稻基因组DNA中进行扩增,得到了景洪直立型绿杆普通野生稻的Pi-ta等位基因的3961 bp序列,由于该序列只是Pi-ta基因的一部分,我们暂时还不能确定该基因是抗病的还是感病的等位基因。
本研究旨在探究景洪直立普通野生稻抗稻瘟病的原因,虽然已从景洪直立型紫杆普通野生稻克隆了抗稻瘟病Pi-ta+等位基因,但是景洪直立普通野生稻中是否还存在其它的已定位的基因或者存在新的抗稻瘟病还有待进一步研究证实。