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背景： 糖尿病足、压力性溃疡以及下肢静脉溃疡等慢性创面是临床常见的疾病，不仅为患者带来极大的痛苦和不便，也让家庭及社会承受巨大的经济负担。以前，人们认为慢性感染创面的细菌与生长在培养液中的浮游细菌并无差异。但近20年的研究表明慢性创面的细菌以一种生物膜的形态生长。生物膜感染的标志性特点是很难被机体的免疫机制清除并且对抗生素等治疗不敏感，形成组织反复的感染并且延迟愈合。细菌生物膜也被认为是临床慢性创面持续或反复感染、延迟愈合的主要原因。 所以，进行针对性治疗生物膜感染的研究非常需要并具有重要意义。然而，迄今为止，关于治疗生物膜慢性感染的具有实用性的研究非常有限。以往的研究主要集中于各种新型敷料的研制，但临床研究表明敷料治疗生物膜感染并未取得较好效果；探寻有效的分子靶点相关研究目前基本仍为体外实验，只有非常少的一部分研究进行了活体实验。所以，临床上慢性创面的治疗仍是传统的清创、冲洗以及抗生素治疗，探寻一种有效的、并且具有实用性的生物膜慢性感染创面的治疗手段具有重要意义。 封闭负压引流治疗（VAC）自从1993年Fleischmann首次应用以来，目前广泛的应用于临床各种创面治疗，而其治疗慢性创面以及感染创面的疗效尤其引人关注。目前VAC治疗创面的机制主要归纳为：增加局部血流、清创坏死、减轻水肿、释放生长因子（由于机械剪切力作用）以及减轻细菌负荷。虽然许多的研究证明VAC可以减轻创面的细菌负荷，但是从没有研究将VAC针对性的应用于治疗生物膜感染这一慢性创面形成的主要原因。所以，本研究通过体内及体外实验针对性研究 VAC治疗 PA生物膜感染创面的效果并对其机制进行较深入的研究。实验共分以下四个部分： 方法与结果： 1.构建兔耳铜绿假单胞菌生物膜感染创面模型。首先将铜绿假单胞菌在体外培养形成生物膜结构，通过扫描电镜、激光共聚焦显微镜、细菌计数等手段于1d、3d及5d观察是否形成生物膜结构。将成熟的生物膜培养片(5d)置于兔耳缺血创面，通过改良革兰氏染色、扫描电镜、透射电镜以及图像分析等方法，观察创面表面及深部细菌形态以及创面愈合情况。结果：铜绿假单胞菌在体外培养5 d形成成熟生物膜结构，将培养片置于兔耳缺血创面3d后形成稳定的生物膜感染创面并明显延迟创面愈合。 2.应用封闭负压引流治疗兔耳铜绿假单胞菌生物膜感染创面。实验分为生物膜对照组（CT组），清创对照组（DC组）以及负压治疗组（VAC组）。负压治疗组根据压力不同分为-50mmHg组、-75mmHg组、-100mmHg组及-125mmHg组。各组分别于治疗前、治疗后1、3、7、14及20天观察创面愈合情况与细菌计数。CT组、DC组以及VAC(-75mmHg)组，于治疗前、治疗后3、6、9、及14天切取组织进行病理学观察、炎症因子检测、透射电镜以及扫描电镜观察。结果：CT组及 DC组创面仍存在细菌生物膜结构，VAC组创面细菌生物膜结构破坏，细菌负荷明显降低（P<0.05），创面愈合加快（P<0.05）。VAC组间比较，-75mmHg组效果最好。VAC(-75mmHg)组肉芽组织增殖速度及炎症因子表达水平高于清创对照组（均P<0.05）。 3.应用封闭负压引流治疗铜绿假单胞菌生物膜的体外研究。实验分为 VAC(-75mmHg)组以及对照组（CT组），应用VAC治疗24h后，通过活菌计数、激光共聚焦显微镜及结晶紫染色法观察创面活菌及生物膜数量，扫面电镜观察细菌形态，RT-PCR检测exoS、exoT、pslA、pelA、rsmY、rsmZ、cbrA及crcZ基因表达变化。结果：与对照组相比，VAC治疗后细菌数量无明显差异，生物膜成分明显减少，细菌由生物膜形态向浮游形态转化。PA急性感染状态的标志基因exoS与exoT表达明显增加（P<0.01），慢性感染状态的标志基因pslA与pelA表达明显下降。rsmY基因与rsmZ基因表达变化并无明显差异，cbrA基因与crcZ基因表达明显减低。 4. VAC通过Crc调控铜绿假单胞菌慢性感染向急性感染的转化。对铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1、crc突变株以及PAO12A（crc突变互补株）群集运动能力、泳动能力、绿脓菌素生成及生物膜形成量进行检测，观察 Crc对 PA的影响。将三种菌株培养的生物膜应用 VAC进行体外研究，观察其生物膜形成量的变化以及exoS、pslA、cbrA及crcZ基因表达变化。结果：crc突变株群集运动能力、泳动能力下降，绿脓菌素及生物膜生成增加，PAO12A与PAO1菌株结果较接近。应用VAC干预后，PAO12A与PAO1生物膜形成量下降，crc突变株无明显变化。crc基因突变株exoS、pslA、cbrA及crcZ基因在VAC作用后无明显改变，PAO1及PAO12A菌株 exoS基因表达增强，pslA、cbrA及crcZ基因表达下降。 结论： 将体外培养PA生物膜置于兔耳缺血创面可形成可靠、可重复的PA生物膜感染创面模型。单一清创手段并不能有效的清除PA生物膜感染创面内细菌，而VAC治疗可以加强创面局部中性粒细胞对细菌的吞噬而降低细菌负荷，并加快肉芽组织增殖而促进PA生物膜感染创面的愈合。VAC单一的机械力作用并不能杀死生物膜内菌细胞，但可调控PA细菌由慢性感染状态（生物膜）向急性感染状态（T3SS）转化，进而抑制PA生物膜成分的形成。Crc可调控PA细菌运动能力、绿脓菌素的生成以及生物膜的形成。VAC治疗可通过CbrA/CbrB-CrcZ-Crc通路调控PA细菌由慢性感染状态向急性感染状态转化，进而抑制PA生物膜成分的形成。