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研究背景:
围产期缺氧缺血性脑病(Hypoxia-ischemia encephalopathy, HIE)是新生儿长期智力、运动障碍和死亡的重要原因之一。HIE主要是由新生儿产时窒息引起的，窒息可由多种原因引起，包括异常的子宫收缩、胎盘早剥、脐带受压等。HIE的发病机制涉及兴奋性毒性、炎症和氧化应激的相互作用，导致急性至长期的脑损伤和功能障碍。虽然目前对HIE的机制研究广泛，但治疗效果不佳，因此迫切需要寻找有效的治疗方法及靶点。
硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是生物体内继一氧化氮和一氧化碳后发现的第三种气体信号分子。在哺乳动物细胞中H2S主要由胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶和3-巯基丙酮酸硫转移酶酶解左旋半胱氨酸(L-Cysteine)和同型半胱氨酸而合成。H2S在心血管、呼吸系统、消化系统和中枢神经系统等中具有潜在的生理作用。H2S在中枢神经系统的生理功能包括通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体调控长时程增强，调节氧化还原反应，维持神经传递中的兴奋/抑制平衡，通过清除自由基和活性物质抑制氧化损伤。H2S也参与中枢神经系统病理过程，例如调节血管生成、谷氨酸介导的兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应、凋亡等。
骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种分泌型磷酸化糖蛋白，细胞粘附及趋化因子，可由体内多种细胞(巨噬细胞，成骨细胞，神经细胞，内皮细胞等)合成并分泌。OPN含有整合素和CD44结合位点，通过与细胞膜上的受体结合，触发多种细胞信号通路，发挥多种功能，如调控细胞增殖和分化，脑血管重构以及免疫调节等。在正常情况下，OPN在脑内表达较弱，而在阿尔兹海默病、帕金森、中风、缺氧缺血性(Hypoxia-ischemia, HI)脑损伤等病理条件下，脑内OPN表达明显增加，研究表明，血浆中的OPN含量与新生小鼠HI脑损伤程度呈正相关。由此，本课题组推测OPN可能在HI脑损伤中发挥重要作用。
研究目的:
研究OPN在新生小鼠HI脑损伤后的作用，探讨OPN在L-Cysteine调节新生小鼠HI脑损伤后神经炎症反应中的作用及机制。
实验方法:
1.新生小鼠HI脑损伤模型的建立:在新生小鼠出生后第7d(Postnatal day 7，P7)，建立HI脑损伤模型，简述如下，沿新生小鼠颈部剪开皮肤暴露并结扎右侧颈总动脉，术后将其放回母鼠身边休息lh，之后将新生小鼠放置于乏氧箱(8％O2与92％N2)缺氧1.5h。假手术组(Sham组)只暴露右侧颈总动脉不进行结扎与缺氧。
2.检测方式
(1)利用蛋白组学检测HI脑损伤后差异表达蛋白。
(2)利用免疫组化、免疫荧光检测OPN在新生小鼠HI脑损伤中的表达及细胞定位。
(3)利用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-ploymerase chain reaction，RT-PCR)检测OPN在mRNA水平的表达变化、Westernblot检测OPN、信号转导子和转录激活子(Signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)、p-Stat3及硫巯基化的Stat3蛋白水平的表达变化。流式细胞技术检测表达OPN的免疫细胞量变化与单核巨噬细胞的浸润。干湿重法、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate，TTC)技术检测脑含水量与脑梗死情况。逆转录及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测炎症因子的表达变化。
(4)利用免疫共沉淀检测OPN与Stat3的关系，生物素法纯化硫巯基化的蛋白。
(5)利用Y迷宫检测HI脑损伤后28d小鼠的空间记忆能力。
实验结果:
1.蛋白组学结果显示OPN是HI脑损伤后上调最明显的蛋白，并且L-Cysteine处理后可降低OPN的表达。
2.免疫组化结果显示，HI脑损伤后72hOPN在损伤侧(右侧)表达明显增加，未损伤侧(左侧)几乎不表达。免疫荧光表明在HI组中OPN与损伤侧激活的小胶质细胞/巨噬细胞共定位，少量的OPN与神经元共定位，OPN不与星形胶质细胞共定位。
3.侧脑室注射OPN抗体后可抑制HI诱导的CD11b+/OPN+细胞量，降低CD11b+/CD45high单核巨噬细胞的浸润及促炎因子的表达，同时可显著改善HI诱导的脑水肿和脑梗死。
4.与HI组相比，L-Cysteine处理可降低HI诱导的CD11b+/OPN+/CD45high细胞量，上调CD11b+/OPN+/CD45low细胞量。氨基氧乙酸(Aminooxyacetic acid,AOAA)(一种H2S产生酶的非特异性抑制剂)可逆转L-Cysteine这些作用。L-Cysteine处理能显著逆转HI损伤诱导的p-Stat3和OPN的表达，AOAA逆转L-Cysteine对p-Stat3和OPN表达的影响。Y迷宫实验结果显示，L-Cysteine处理可改善小鼠HI脑损伤后的空间学习记忆能力。
5.免疫共沉淀结果显示，OPN与Stat3之间存在相互作用关系。Stat3siRNA可明显降低OPN的表达，同时可改善HI损伤诱导的脑水肿和脑梗死。在离体实验BV-2细胞中，L-Cysteine处理能显著逆转LPS诱导的OPN和p-Star3的表达及上调Stat3的硫巯基化作用。AOAA逆转L-Cysteine这一作用。
实验结论:
本研究表明，抑制OPN的表达可降低新生小鼠HI脑损伤后的炎症反应;L-Cysteine诱导Stat3的硫巯基化，降低OPN的表达，从而抑制新生小鼠HI脑损伤后的神经炎症反应，发挥神经保护作用。
围产期缺氧缺血性脑病(Hypoxia-ischemia encephalopathy, HIE)是新生儿长期智力、运动障碍和死亡的重要原因之一。HIE主要是由新生儿产时窒息引起的，窒息可由多种原因引起，包括异常的子宫收缩、胎盘早剥、脐带受压等。HIE的发病机制涉及兴奋性毒性、炎症和氧化应激的相互作用，导致急性至长期的脑损伤和功能障碍。虽然目前对HIE的机制研究广泛，但治疗效果不佳，因此迫切需要寻找有效的治疗方法及靶点。
硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是生物体内继一氧化氮和一氧化碳后发现的第三种气体信号分子。在哺乳动物细胞中H2S主要由胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶和3-巯基丙酮酸硫转移酶酶解左旋半胱氨酸(L-Cysteine)和同型半胱氨酸而合成。H2S在心血管、呼吸系统、消化系统和中枢神经系统等中具有潜在的生理作用。H2S在中枢神经系统的生理功能包括通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体调控长时程增强，调节氧化还原反应，维持神经传递中的兴奋/抑制平衡，通过清除自由基和活性物质抑制氧化损伤。H2S也参与中枢神经系统病理过程，例如调节血管生成、谷氨酸介导的兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应、凋亡等。
骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种分泌型磷酸化糖蛋白，细胞粘附及趋化因子，可由体内多种细胞(巨噬细胞，成骨细胞，神经细胞，内皮细胞等)合成并分泌。OPN含有整合素和CD44结合位点，通过与细胞膜上的受体结合，触发多种细胞信号通路，发挥多种功能，如调控细胞增殖和分化，脑血管重构以及免疫调节等。在正常情况下，OPN在脑内表达较弱，而在阿尔兹海默病、帕金森、中风、缺氧缺血性(Hypoxia-ischemia, HI)脑损伤等病理条件下，脑内OPN表达明显增加，研究表明，血浆中的OPN含量与新生小鼠HI脑损伤程度呈正相关。由此，本课题组推测OPN可能在HI脑损伤中发挥重要作用。
研究目的:
研究OPN在新生小鼠HI脑损伤后的作用，探讨OPN在L-Cysteine调节新生小鼠HI脑损伤后神经炎症反应中的作用及机制。
实验方法:
1.新生小鼠HI脑损伤模型的建立:在新生小鼠出生后第7d(Postnatal day 7，P7)，建立HI脑损伤模型，简述如下，沿新生小鼠颈部剪开皮肤暴露并结扎右侧颈总动脉，术后将其放回母鼠身边休息lh，之后将新生小鼠放置于乏氧箱(8％O2与92％N2)缺氧1.5h。假手术组(Sham组)只暴露右侧颈总动脉不进行结扎与缺氧。
2.检测方式
(1)利用蛋白组学检测HI脑损伤后差异表达蛋白。
(2)利用免疫组化、免疫荧光检测OPN在新生小鼠HI脑损伤中的表达及细胞定位。
(3)利用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-ploymerase chain reaction，RT-PCR)检测OPN在mRNA水平的表达变化、Westernblot检测OPN、信号转导子和转录激活子(Signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)、p-Stat3及硫巯基化的Stat3蛋白水平的表达变化。流式细胞技术检测表达OPN的免疫细胞量变化与单核巨噬细胞的浸润。干湿重法、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate，TTC)技术检测脑含水量与脑梗死情况。逆转录及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测炎症因子的表达变化。
(4)利用免疫共沉淀检测OPN与Stat3的关系，生物素法纯化硫巯基化的蛋白。
(5)利用Y迷宫检测HI脑损伤后28d小鼠的空间记忆能力。
实验结果:
1.蛋白组学结果显示OPN是HI脑损伤后上调最明显的蛋白，并且L-Cysteine处理后可降低OPN的表达。
2.免疫组化结果显示，HI脑损伤后72hOPN在损伤侧(右侧)表达明显增加，未损伤侧(左侧)几乎不表达。免疫荧光表明在HI组中OPN与损伤侧激活的小胶质细胞/巨噬细胞共定位，少量的OPN与神经元共定位，OPN不与星形胶质细胞共定位。
3.侧脑室注射OPN抗体后可抑制HI诱导的CD11b+/OPN+细胞量，降低CD11b+/CD45high单核巨噬细胞的浸润及促炎因子的表达，同时可显著改善HI诱导的脑水肿和脑梗死。
4.与HI组相比，L-Cysteine处理可降低HI诱导的CD11b+/OPN+/CD45high细胞量，上调CD11b+/OPN+/CD45low细胞量。氨基氧乙酸(Aminooxyacetic acid,AOAA)(一种H2S产生酶的非特异性抑制剂)可逆转L-Cysteine这些作用。L-Cysteine处理能显著逆转HI损伤诱导的p-Stat3和OPN的表达，AOAA逆转L-Cysteine对p-Stat3和OPN表达的影响。Y迷宫实验结果显示，L-Cysteine处理可改善小鼠HI脑损伤后的空间学习记忆能力。
5.免疫共沉淀结果显示，OPN与Stat3之间存在相互作用关系。Stat3siRNA可明显降低OPN的表达，同时可改善HI损伤诱导的脑水肿和脑梗死。在离体实验BV-2细胞中，L-Cysteine处理能显著逆转LPS诱导的OPN和p-Star3的表达及上调Stat3的硫巯基化作用。AOAA逆转L-Cysteine这一作用。
实验结论:
本研究表明，抑制OPN的表达可降低新生小鼠HI脑损伤后的炎症反应;L-Cysteine诱导Stat3的硫巯基化，降低OPN的表达，从而抑制新生小鼠HI脑损伤后的神经炎症反应，发挥神经保护作用。