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炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因不明的非特异性的慢性肠道炎症性疾病，主要包括(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohns disease，CD)。该疾病在西方国家的患病率很高，过去十年在我国迅速发展。由于迄今为止，对该病的病理机制尚不明确，故仍缺乏有效治疗方法，易复发，给患者造成巨大负担。今年来，多有学者认为IBD与免疫异常有关。
缩宫素(Oxytocin，OXT)是一种经典的神经肽类激素，主要由下丘脑产生，在垂体后叶释放。OXT通过激活其受体(Oxytocin Receptor，OXTR)在哺乳动物分娩、泌乳、母婴连结以及社会交往中起到重要的生理作用。既往研究中，我们和其他实验室证实OXT及OXTR在肠道神经元中表达，其在内脏痛传导中发挥调节功能。最近我们发现OXT能够缓解DSS诱导小鼠结肠炎。相反全身敲除OXTR后TNBS诱导的结肠炎更加严重。但是OXT在其中的作用机制尚不明确。
树突状细胞(dendritic cells，DCs)是最重要的抗原提呈细胞。其在固有免疫和获得性免疫应答的调节中都起到重要作用，能够介导炎症反应或者参与免疫耐受。在稳态下，不成熟或者半成熟的DCs较低表达MHC类分子和共刺激分子，主要功能是摄取和加工抗原，并将自身抗原呈递给T细胞，使T细胞缺失或者诱导产生调节T细胞(Treg)，从而介导免疫耐受。而在获取或者受到如LPS或者TNFα刺激时，未成熟的DCs开始分化成熟。成熟的DCs高表达MHC类分子和共刺激分子。此时的DCs与IL6、IL23和TNFα等炎症因子共同作用促使CD4+T细胞分化成Th1或Th17细胞引起结肠免疫应答，导致肠道组织受损，最终发展成IBD。
我们发现树突状细胞(dendritic cells，DCs)也表达OXTR。基于OXT的抗炎功能以及DCs在IBD中发挥免疫调节作用，我们首次揭示OXT通过影响DCs功能，调节肠道黏膜免疫应答，发挥缓解IBD的作用。本研究将为临床治疗IBD提供新的方法和理论依据。
第一部分缩宫素在树突状细胞中的调节作用及其机制
实验目的:
已有报道OXT具有免疫调节作用，但是具体的机制仍然不明确。DCs是最重要的抗原提呈细胞，其在调节固有免疫和获得性免疫应答中都起到了重要的作用，参与介导炎症反应或者免疫耐受。本研究的目的是探究OXT/OXTR信号系统是否影响DCs的功能，并探究其机制。
实验方法:
1.用GM-CSF和IL4体外诱导小鼠骨髓来源的DCs(Bone marrow-derived DCs，BMDCs)。
2.用percoll密度梯度离心法分离肠道固有层单个核细胞(lamina propria monomuclear cells，LPMCs)，用CD11c阳选磁珠进行分选获得固有层树突状细胞(lamina propria dendritic cells，LPDCs)。
3.通过免疫荧光和蛋白免疫印迹实验检测OXTR在DCs上的表达情况。
4.利用CD11c-cre小鼠和OXTR-flox/flox(OXTRfl/fl)小鼠进行杂交，获得特异敲除CD11c+细胞上OXTR的小鼠(OXTR△DC小鼠)。
5.BMDCs刺激方法:在第七天收集诱导的BMDCs，分别加入OXT、LPS或者OXT预先孵育40分钟后再加入LPS刺激。如果需要使用抑制剂，先用抑制剂孵育BMDCs20分钟。BMDCs在37℃5％CO2培养箱中培养。
6.通过流式细胞术检测BMDCs膜表面MHC分子和CD80、CD86表达。
7.利用qPCR和ELISA检测BMDCs产生的细胞因子。
8.利用FITC-dextran检测BMDCs吞噬能力。
9.利用FITC标记的乳酸杆菌和沙门氏菌检测BMDCs粘附细菌的能力。
10.不同处理的BMDCs与初始CD4+T细胞共培养，利用流式细胞术检测CD4+T细胞分化。
11.通过蛋白免疫印迹检测DCs中AKT和IκB磷酸化水平。
实验结果:
1.成功诱导BMDCs
通过流式细胞术检测细胞表面CD11c表达大于90％，显微镜下观察到典型的DCs形态。
2.DCs表达OXTR
通过免疫荧光和免疫印迹检测小鼠BMDCs和肠LPDCs上OXTR表达情况。通过免疫荧光检测OXTR在人肠道DCs表达情况，采用CD11c标记DCs。结果显示小鼠BMDCs和LPDCs均表达OXTR，同样人的LPDCs也表达OXTR。
3.OXTR△DC小鼠构建成功
使用OXTRfl/fl小鼠与CD11c-Cre小鼠进行交配。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对子鼠进行基因鉴定。OXTR-flox阳性条带为375bp，CD11c-Cre阳性条带为313bp。OXTRfl/flCD11c-Cre基因型小鼠即为OXTR△DC小鼠。用qPCR检测OXTRfl/fl小鼠和OXTR△DC小鼠的BMDCs的OXTR表达，OXTR△DC小鼠的BMDCs的OXTR表达明显减少。用免疫印迹检测OXTRfl/fl小鼠和OXTR△DC小鼠的LPDCs的OXTR表达，OXTR△DC小鼠的LPDCs的OXTR表达明显减少。
4.OXT抑制DCs成熟
4.1OXT抑制DCs表面表达MHCⅡ及共刺激分子
用LPS(100ng/ml，24小时)刺激BMDCs，BMDCs表面MHCⅡ、CD80和CD86的表达增加。而预先孵育OXT(10-8M，40分钟)，LPS的作用被抑制了。
4.2OXT增强BMDCs的吞噬能力
孵育OXT(24小时)增强未成熟BMDCs对FITC-Dextran的吞噬能力。预孵育OXT(10-8M，40分钟)增强成熟的BMDCs的吞噬能力。
4.3OXT通过OXTR抑制BMDCs产生炎症因子
我们用qPCR检测细胞因子在转录水平的表达情况。LPS(100ng/ml，24小时)刺激BMDCs，无论OXTRfl/fl小鼠的BMDCs还是OXTR△DC小鼠的BMDCs中，Tnfα、Il12a以及Il23a表达均明显升高。提前孵育OXT的OXTRfl/fl小鼠BMDCs，明显减低Tnfα、Il12a以及Il23a的表达。而提前孵育OXT的OXTR△DC小鼠BMDCs并不显著影响这些细胞因子的表达。
我们用ELISA法检测BMDCs分泌到培养基中的炎症因子。LPS促进OXTRfl/fl的BMDCs分泌IL12p70和IL6，提前孵育OXT抑制了这些细胞因子的分泌。而对于OXTR△DC的BMDCs，用LPS刺激BMDCs24小时，IL12p70和IL6分泌增加。但是提前孵育OXT不能抑制LPS对BMDCs的作用。
5.OXT通过其受体抑制BMDCs刺激T细胞应答的能力
OXTRffl/flBMDCs和OXTR△DCBMDCs分别经LPS刺激或者先经OXT孵呼育40分钟再经LPS刺激24小时。分离DSS诱导的结肠炎小鼠的肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN)，通过磁珠分选获得初始CD4+T细胞。分离的初始CD4+T细胞与BMDCs按1000∶1的比例混匀培养3天，通过流式细胞术检测CD4+T细胞的分化情况。与LPS刺激的OXTRfl/flBMDCs共培养的T细胞相比，提前孵育OXT的BMDCs抑制初始CD4+T细胞分化为Th1和Th17，但是不会影响Treg的分化。对于OXTR△DCBMDCs，提前孵育OXT不影响初始CD4+T分化。
6.OXT影响BMDCs对细菌的粘附作用
OXT孵育的BMDCs促进其对的益生菌乳酸杆菌粘附，但是抑制对致病菌沙门氏菌的粘附。
7.OXT激活BMDCs中PI3K/AKT信号通路抑制BMDCs的成熟
7.1OXT激活PI3K/AKT通路
孵育OXT(10-8M)促进BMDCs的AKT的磷酸化，该磷酸化被PI3K抑制剂AS605240、Wortmannin和Ly294002，AKT抑制剂MK2206以及mTOR抑制剂Rapamycin所抑制。
7.2OXT抑制LPS激活的NFκB通路
LPS促进BMDCs中NFκB的抑制物IκB的磷酸化和降解;提取孵育OXT(10-8M，40分钟)抑制了IκB的磷酸化。孵育PI3K抑制剂Wortmannin、AKT抑制剂MK220620分钟，OXT不再抑制IκB的磷酸化。
7.3OXT通过激活PI3K/AKT抑制BMDCs表达MHCⅡ和共刺激分子
加入PI3K抑制剂AS605240、Wortmannin，AKT抑制剂MK2206以及mTOR抑制剂Rapamycin后，LPS刺激BMDCs表达MHCⅡ和CD86不再被OXT抑制。
小结:
1.DCs表达OXTR。
2.OXT通过激活AKT通路下调NFκB活性，抑制DCs的成熟。
3.OXT通过抑制DCs成熟，抑制其抗原提呈能力，抑制CD4+T细胞分化为Th1和Th17，起到抗炎作用。
第二部分树突状细胞通过缩宫素信号系统在实验性结肠炎中的作用
实验目的:
第一部分结果已经证实OXT抑制DCs的成熟及抗原提呈。DCs中OXT信号系统是否在IBD中发挥作用尚无报道。因此，我们通过构建DSS诱导的小鼠急性和慢性结肠炎模型，来探究DCs中OXT信号系统在IBD的发展中的作用及机制。
实验方法:
1.使用ELISA检测IBD病人与正常人(HC，Health Control)血浆中OXT的含量
2.使用qPCR检测DSS小鼠与正常小鼠LPDCs上Oxtr的mRNA表达
3.使用qPCR检测DSS小鼠与正常小鼠LPDCs中Tnfα和Il12a的mRNA表达
4.建立DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型
使用8-10周C57BL/6背景的野生小鼠、OXTR△DC小鼠及其同窝OXTRfl/fl小鼠。
在DSS诱导的急性结肠炎模型中，OXTR△DC小鼠及其同窝OXTRfl/fl小鼠自由饮用2％DSS水溶液，7天。OXTRfl/fl-water组和OXTR△DC-water组自由饮用正常水。
在回输BMDCs实验中，小鼠自由饮用2.5％DSS水溶液，7天。在造模的第4天和第6天小鼠尾静脉注射BMDCs(106个细胞/只/天)或生理盐水(Control)。其中DC(Control)组注射只用LPS(100ng/ml，24小时)刺激的BMDCs，DC(OXT)组注射先用OXT(10-8M)孵育40分钟，再用LPS刺激BMDCs。
在慢性DSS诱导的结肠炎模型中，采用间断式饮用DSS的方法，进行三个周期:分别给予3％、1.5％和2％的DSS水溶液各5天，在每次DSS之后给予7天的正常饮用水。
造模期间每天记录小鼠体重，计算小鼠体重变化率。造模结束后，检测小鼠粪便情况、测量小鼠结肠长度。结肠组织前段提取RNA，后段固定在4％多聚甲醛中过夜之后石蜡包埋，切片进行H&E染色，进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分和组织学评分。
5.流式细胞术分析小鼠肠道固有层DCs及T细胞变化情况
5.1流式细胞术分析小鼠肠道DCs变化
用percoll密度梯度离心分离DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠LPMCs。LPMCS通过标记MHCⅡ-FITC，CD64-PE，CD103-Percp/Cy5.5，CD11c-APC，CD45-APC/Fire750,CD11b-PacificBlue分出CD103+CD11b+、CD103+CD11b-和CD103-CD11b+三种LPDCs亚群。
5.2流式细胞术分析小鼠肠道T细胞变化
用percoll密度梯度离心分离LPMCs，通过标记CD4-FITC、Foxp3-PE、IFNγ-Percp/Cy5.5和IL17A-APC分出CD4+Foxp3+的Treg细胞、CD4+IFNγ+的Th1细胞以及CD4+IL17A+的Th17细胞。
6.qPCR检测小鼠肠道细胞因子以及相关转录因子表达
6.1提取结肠组织中的RNA，逆转录成为cDNA，用qPCR检测Il6，Il23a和Tgfβ表达
6.2提取结肠组织中的RNA，逆转录成为cDNA，用qPCR检测Th1相关转录因子T-bet，Th2相关转录因子Gata3，Th17相关转录因子Rorγt以及Treg相关转录因子Foxp3表达
实验结果:
1.与正常人相比，IBD病人血浆中OXT含量增加。
2.与正常小鼠相比，DSS的结肠炎模型小鼠LPDCs上OXtr的mRNA表达降低
3.与正常小鼠相比，DSS的结肠炎模型小鼠LPDCs上Tnfα和Il12a的mRNA表达升高
4.OXTR△DC小鼠对DSS诱导的急性结肠炎更加敏感
造模第7天，OXTRfl/fl-water组和OXTR△DC-water组体重无明显变化，结肠无明显差异。
与OXTRfl/fl-DSS肠炎组小鼠相比，OXTR△DC-DSS肠炎组小鼠体重明显降低，结肠缩短，DAI评分增加，组织学评分升高。
与OXTRfl/fl-DSS肠炎组小鼠相比，OXTR△DC-DSS肠炎组小鼠结肠炎症因子Il6和Il23的mRNA表达增加，而抑炎因子Tgfβ表达减少。
5.OXTR△DC小鼠DSS诱导的急性结肠炎固有层DCs和T细胞分群发生改变
5.1OXTR△DC小鼠DSS诱导的急性结肠炎的LPDCs分群发生改变
通过流式圈门CD45+CD11c+MHCⅡ+CD64-得到LPDCs。在根据是否表达CD11b和CD103将LPDCs进行分群，与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比，OXTR△DC肠炎组小鼠CD103+CD11b+LPDCs亚群比例更高，而CD103+CD11b-LPDCs和CD103-CD11b+LPDCs亚群无明显变化。
5.2OXTR△DC小鼠DSS诱导的急性结肠炎结肠中的Th1和Th17亚群比例增加
流式细胞术的结果表明，与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比，OXTR△DC肠炎组小鼠结肠中CD4+IFNγ+Th1、CD4+IL17A+Th17细胞比例更高，而CD4+Foxp3+Treg的比例无明显变化。
qPCR的结果表明，与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比，OXTR△DC肠炎组小鼠肠道中Th1相关转录因子T-bet、Th17相关转录因子Rorγt的mRNA表达升高，而Th2相关转录因子Gata3、Treg相关转录因子Foxp3的mRNA表达没有明显变化。
6.OXTR△DC小鼠对DSS诱导的慢性结肠炎更敏感
慢性结肠炎模型中，OXTRfl/fl小鼠体重随着是否饮用DSS呈波动性变化，并在造模结束时体重恢复到实验初期。与之对比，OXTR△DC小鼠体重尽管也呈现波动性变化，但是在饮用正常水期间体重恢复迟缓，在造模结束时体重仍然低于造模初期。与OXTRfl/fl小鼠相比，OXTR△DC小鼠结肠更短，DAI评分和组织学评分更高。炎症因子I16和Il23的mRNA表达增加，而抑炎因子Tgfβ表达减少。
7.在慢性结肠炎小鼠中，OXTR△DC小鼠肠道固有层中T细胞倾向于向Th17方向分化
与OXTRfl/fl小鼠相比，OXTR△DC小鼠肠道Th17相关转录因子Rorγt的mRNA表达更高，而其他相关转录因子表达量无明显变化。
8.回输OXT孵育过的BMDCs缓解DSS诱导的小鼠急性结肠炎
BMDCs在有OXT(DC (OXT))或无OXT(DC(Control))孵育后经LPS刺激成熟。在回输BMDCs实验中，DC(OXT)组小鼠体重降低程度明显小于DC(Control)组小鼠和Control组小鼠。同样，DC(OXT)组小鼠结肠长度比DC(Control)组小鼠和Control小鼠长，DAI评分低，组织学评分低。
小结:
1.IBD患者血浆中OXT异常升高。
2.肠炎时，DCs的OXT信号影响LPDCs亚群比例及CD4+T细胞分化。当条件敲除DCs上OXTR(OXTR△DC)时，DSS诱导的结肠炎加重，肠黏膜CD103+CD11b+DCs亚群比例更高，CD4+T倾向于Th1及Th17分化。
3.静脉回输OXT孵育过的BMDCs能够缓解DSS诱导的结肠炎。这可能为临床治疗IBD提供新的方法参考。
实验结论与创新性:
1.OXT的抗炎作用已经被广泛认知，但是绝大多数的研究集中在巨噬细胞或者神经细胞上，我们的研究首次证明DCs表达OXTR，并且OXT通过激活DCs上的OXTR也起到了抗炎的作用。
2.在体外，OXT通过激活AKT通路下调NFκB活性，抑制DCs的成熟，抑制Th1和Th17分化，从而限制LPS诱导的炎症反应。
3.在体内，OXT信号系统影响CD103+CD11b+LPDCs亚群比例，抑制Th1和Th17分化，限制IBD的进一步发展。
4.静脉注射OXT孵育的BMDCs缓解DSS诱导的实验性结肠炎，可能为临床治疗IBD提供新的方法。
5.该研究进一步证明神经肽OXT参与免疫调节作用，为神经-免疫交流提供新的证据。
缩宫素(Oxytocin，OXT)是一种经典的神经肽类激素，主要由下丘脑产生，在垂体后叶释放。OXT通过激活其受体(Oxytocin Receptor，OXTR)在哺乳动物分娩、泌乳、母婴连结以及社会交往中起到重要的生理作用。既往研究中，我们和其他实验室证实OXT及OXTR在肠道神经元中表达，其在内脏痛传导中发挥调节功能。最近我们发现OXT能够缓解DSS诱导小鼠结肠炎。相反全身敲除OXTR后TNBS诱导的结肠炎更加严重。但是OXT在其中的作用机制尚不明确。
树突状细胞(dendritic cells，DCs)是最重要的抗原提呈细胞。其在固有免疫和获得性免疫应答的调节中都起到重要作用，能够介导炎症反应或者参与免疫耐受。在稳态下，不成熟或者半成熟的DCs较低表达MHC类分子和共刺激分子，主要功能是摄取和加工抗原，并将自身抗原呈递给T细胞，使T细胞缺失或者诱导产生调节T细胞(Treg)，从而介导免疫耐受。而在获取或者受到如LPS或者TNFα刺激时，未成熟的DCs开始分化成熟。成熟的DCs高表达MHC类分子和共刺激分子。此时的DCs与IL6、IL23和TNFα等炎症因子共同作用促使CD4+T细胞分化成Th1或Th17细胞引起结肠免疫应答，导致肠道组织受损，最终发展成IBD。
我们发现树突状细胞(dendritic cells，DCs)也表达OXTR。基于OXT的抗炎功能以及DCs在IBD中发挥免疫调节作用，我们首次揭示OXT通过影响DCs功能，调节肠道黏膜免疫应答，发挥缓解IBD的作用。本研究将为临床治疗IBD提供新的方法和理论依据。
第一部分缩宫素在树突状细胞中的调节作用及其机制
实验目的:
已有报道OXT具有免疫调节作用，但是具体的机制仍然不明确。DCs是最重要的抗原提呈细胞，其在调节固有免疫和获得性免疫应答中都起到了重要的作用，参与介导炎症反应或者免疫耐受。本研究的目的是探究OXT/OXTR信号系统是否影响DCs的功能，并探究其机制。
实验方法:
1.用GM-CSF和IL4体外诱导小鼠骨髓来源的DCs(Bone marrow-derived DCs，BMDCs)。
2.用percoll密度梯度离心法分离肠道固有层单个核细胞(lamina propria monomuclear cells，LPMCs)，用CD11c阳选磁珠进行分选获得固有层树突状细胞(lamina propria dendritic cells，LPDCs)。
3.通过免疫荧光和蛋白免疫印迹实验检测OXTR在DCs上的表达情况。
4.利用CD11c-cre小鼠和OXTR-flox/flox(OXTRfl/fl)小鼠进行杂交，获得特异敲除CD11c+细胞上OXTR的小鼠(OXTR△DC小鼠)。
5.BMDCs刺激方法:在第七天收集诱导的BMDCs，分别加入OXT、LPS或者OXT预先孵育40分钟后再加入LPS刺激。如果需要使用抑制剂，先用抑制剂孵育BMDCs20分钟。BMDCs在37℃5％CO2培养箱中培养。
6.通过流式细胞术检测BMDCs膜表面MHC分子和CD80、CD86表达。
7.利用qPCR和ELISA检测BMDCs产生的细胞因子。
8.利用FITC-dextran检测BMDCs吞噬能力。
9.利用FITC标记的乳酸杆菌和沙门氏菌检测BMDCs粘附细菌的能力。
10.不同处理的BMDCs与初始CD4+T细胞共培养，利用流式细胞术检测CD4+T细胞分化。
11.通过蛋白免疫印迹检测DCs中AKT和IκB磷酸化水平。
实验结果:
1.成功诱导BMDCs
通过流式细胞术检测细胞表面CD11c表达大于90％，显微镜下观察到典型的DCs形态。
2.DCs表达OXTR
通过免疫荧光和免疫印迹检测小鼠BMDCs和肠LPDCs上OXTR表达情况。通过免疫荧光检测OXTR在人肠道DCs表达情况，采用CD11c标记DCs。结果显示小鼠BMDCs和LPDCs均表达OXTR，同样人的LPDCs也表达OXTR。
3.OXTR△DC小鼠构建成功
使用OXTRfl/fl小鼠与CD11c-Cre小鼠进行交配。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对子鼠进行基因鉴定。OXTR-flox阳性条带为375bp，CD11c-Cre阳性条带为313bp。OXTRfl/flCD11c-Cre基因型小鼠即为OXTR△DC小鼠。用qPCR检测OXTRfl/fl小鼠和OXTR△DC小鼠的BMDCs的OXTR表达，OXTR△DC小鼠的BMDCs的OXTR表达明显减少。用免疫印迹检测OXTRfl/fl小鼠和OXTR△DC小鼠的LPDCs的OXTR表达，OXTR△DC小鼠的LPDCs的OXTR表达明显减少。
4.OXT抑制DCs成熟
4.1OXT抑制DCs表面表达MHCⅡ及共刺激分子
用LPS(100ng/ml，24小时)刺激BMDCs，BMDCs表面MHCⅡ、CD80和CD86的表达增加。而预先孵育OXT(10-8M，40分钟)，LPS的作用被抑制了。
4.2OXT增强BMDCs的吞噬能力
孵育OXT(24小时)增强未成熟BMDCs对FITC-Dextran的吞噬能力。预孵育OXT(10-8M，40分钟)增强成熟的BMDCs的吞噬能力。
4.3OXT通过OXTR抑制BMDCs产生炎症因子
我们用qPCR检测细胞因子在转录水平的表达情况。LPS(100ng/ml，24小时)刺激BMDCs，无论OXTRfl/fl小鼠的BMDCs还是OXTR△DC小鼠的BMDCs中，Tnfα、Il12a以及Il23a表达均明显升高。提前孵育OXT的OXTRfl/fl小鼠BMDCs，明显减低Tnfα、Il12a以及Il23a的表达。而提前孵育OXT的OXTR△DC小鼠BMDCs并不显著影响这些细胞因子的表达。
我们用ELISA法检测BMDCs分泌到培养基中的炎症因子。LPS促进OXTRfl/fl的BMDCs分泌IL12p70和IL6，提前孵育OXT抑制了这些细胞因子的分泌。而对于OXTR△DC的BMDCs，用LPS刺激BMDCs24小时，IL12p70和IL6分泌增加。但是提前孵育OXT不能抑制LPS对BMDCs的作用。
5.OXT通过其受体抑制BMDCs刺激T细胞应答的能力
OXTRffl/flBMDCs和OXTR△DCBMDCs分别经LPS刺激或者先经OXT孵呼育40分钟再经LPS刺激24小时。分离DSS诱导的结肠炎小鼠的肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN)，通过磁珠分选获得初始CD4+T细胞。分离的初始CD4+T细胞与BMDCs按1000∶1的比例混匀培养3天，通过流式细胞术检测CD4+T细胞的分化情况。与LPS刺激的OXTRfl/flBMDCs共培养的T细胞相比，提前孵育OXT的BMDCs抑制初始CD4+T细胞分化为Th1和Th17，但是不会影响Treg的分化。对于OXTR△DCBMDCs，提前孵育OXT不影响初始CD4+T分化。
6.OXT影响BMDCs对细菌的粘附作用
OXT孵育的BMDCs促进其对的益生菌乳酸杆菌粘附，但是抑制对致病菌沙门氏菌的粘附。
7.OXT激活BMDCs中PI3K/AKT信号通路抑制BMDCs的成熟
7.1OXT激活PI3K/AKT通路
孵育OXT(10-8M)促进BMDCs的AKT的磷酸化，该磷酸化被PI3K抑制剂AS605240、Wortmannin和Ly294002，AKT抑制剂MK2206以及mTOR抑制剂Rapamycin所抑制。
7.2OXT抑制LPS激活的NFκB通路
LPS促进BMDCs中NFκB的抑制物IκB的磷酸化和降解;提取孵育OXT(10-8M，40分钟)抑制了IκB的磷酸化。孵育PI3K抑制剂Wortmannin、AKT抑制剂MK220620分钟，OXT不再抑制IκB的磷酸化。
7.3OXT通过激活PI3K/AKT抑制BMDCs表达MHCⅡ和共刺激分子
加入PI3K抑制剂AS605240、Wortmannin，AKT抑制剂MK2206以及mTOR抑制剂Rapamycin后，LPS刺激BMDCs表达MHCⅡ和CD86不再被OXT抑制。
小结:
1.DCs表达OXTR。
2.OXT通过激活AKT通路下调NFκB活性，抑制DCs的成熟。
3.OXT通过抑制DCs成熟，抑制其抗原提呈能力，抑制CD4+T细胞分化为Th1和Th17，起到抗炎作用。
第二部分树突状细胞通过缩宫素信号系统在实验性结肠炎中的作用
实验目的:
第一部分结果已经证实OXT抑制DCs的成熟及抗原提呈。DCs中OXT信号系统是否在IBD中发挥作用尚无报道。因此，我们通过构建DSS诱导的小鼠急性和慢性结肠炎模型，来探究DCs中OXT信号系统在IBD的发展中的作用及机制。
实验方法:
1.使用ELISA检测IBD病人与正常人(HC，Health Control)血浆中OXT的含量
2.使用qPCR检测DSS小鼠与正常小鼠LPDCs上Oxtr的mRNA表达
3.使用qPCR检测DSS小鼠与正常小鼠LPDCs中Tnfα和Il12a的mRNA表达
4.建立DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型
使用8-10周C57BL/6背景的野生小鼠、OXTR△DC小鼠及其同窝OXTRfl/fl小鼠。
在DSS诱导的急性结肠炎模型中，OXTR△DC小鼠及其同窝OXTRfl/fl小鼠自由饮用2％DSS水溶液，7天。OXTRfl/fl-water组和OXTR△DC-water组自由饮用正常水。
在回输BMDCs实验中，小鼠自由饮用2.5％DSS水溶液，7天。在造模的第4天和第6天小鼠尾静脉注射BMDCs(106个细胞/只/天)或生理盐水(Control)。其中DC(Control)组注射只用LPS(100ng/ml，24小时)刺激的BMDCs，DC(OXT)组注射先用OXT(10-8M)孵育40分钟，再用LPS刺激BMDCs。
在慢性DSS诱导的结肠炎模型中，采用间断式饮用DSS的方法，进行三个周期:分别给予3％、1.5％和2％的DSS水溶液各5天，在每次DSS之后给予7天的正常饮用水。
造模期间每天记录小鼠体重，计算小鼠体重变化率。造模结束后，检测小鼠粪便情况、测量小鼠结肠长度。结肠组织前段提取RNA，后段固定在4％多聚甲醛中过夜之后石蜡包埋，切片进行H&E染色，进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分和组织学评分。
5.流式细胞术分析小鼠肠道固有层DCs及T细胞变化情况
5.1流式细胞术分析小鼠肠道DCs变化
用percoll密度梯度离心分离DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠LPMCs。LPMCS通过标记MHCⅡ-FITC，CD64-PE，CD103-Percp/Cy5.5，CD11c-APC，CD45-APC/Fire750,CD11b-PacificBlue分出CD103+CD11b+、CD103+CD11b-和CD103-CD11b+三种LPDCs亚群。
5.2流式细胞术分析小鼠肠道T细胞变化
用percoll密度梯度离心分离LPMCs，通过标记CD4-FITC、Foxp3-PE、IFNγ-Percp/Cy5.5和IL17A-APC分出CD4+Foxp3+的Treg细胞、CD4+IFNγ+的Th1细胞以及CD4+IL17A+的Th17细胞。
6.qPCR检测小鼠肠道细胞因子以及相关转录因子表达
6.1提取结肠组织中的RNA，逆转录成为cDNA，用qPCR检测Il6，Il23a和Tgfβ表达
6.2提取结肠组织中的RNA，逆转录成为cDNA，用qPCR检测Th1相关转录因子T-bet，Th2相关转录因子Gata3，Th17相关转录因子Rorγt以及Treg相关转录因子Foxp3表达
实验结果:
1.与正常人相比，IBD病人血浆中OXT含量增加。
2.与正常小鼠相比，DSS的结肠炎模型小鼠LPDCs上OXtr的mRNA表达降低
3.与正常小鼠相比，DSS的结肠炎模型小鼠LPDCs上Tnfα和Il12a的mRNA表达升高
4.OXTR△DC小鼠对DSS诱导的急性结肠炎更加敏感
造模第7天，OXTRfl/fl-water组和OXTR△DC-water组体重无明显变化，结肠无明显差异。
与OXTRfl/fl-DSS肠炎组小鼠相比，OXTR△DC-DSS肠炎组小鼠体重明显降低，结肠缩短，DAI评分增加，组织学评分升高。
与OXTRfl/fl-DSS肠炎组小鼠相比，OXTR△DC-DSS肠炎组小鼠结肠炎症因子Il6和Il23的mRNA表达增加，而抑炎因子Tgfβ表达减少。
5.OXTR△DC小鼠DSS诱导的急性结肠炎固有层DCs和T细胞分群发生改变
5.1OXTR△DC小鼠DSS诱导的急性结肠炎的LPDCs分群发生改变
通过流式圈门CD45+CD11c+MHCⅡ+CD64-得到LPDCs。在根据是否表达CD11b和CD103将LPDCs进行分群，与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比，OXTR△DC肠炎组小鼠CD103+CD11b+LPDCs亚群比例更高，而CD103+CD11b-LPDCs和CD103-CD11b+LPDCs亚群无明显变化。
5.2OXTR△DC小鼠DSS诱导的急性结肠炎结肠中的Th1和Th17亚群比例增加
流式细胞术的结果表明，与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比，OXTR△DC肠炎组小鼠结肠中CD4+IFNγ+Th1、CD4+IL17A+Th17细胞比例更高，而CD4+Foxp3+Treg的比例无明显变化。
qPCR的结果表明，与OXTRfl/fl肠炎组小鼠相比，OXTR△DC肠炎组小鼠肠道中Th1相关转录因子T-bet、Th17相关转录因子Rorγt的mRNA表达升高，而Th2相关转录因子Gata3、Treg相关转录因子Foxp3的mRNA表达没有明显变化。
6.OXTR△DC小鼠对DSS诱导的慢性结肠炎更敏感
慢性结肠炎模型中，OXTRfl/fl小鼠体重随着是否饮用DSS呈波动性变化，并在造模结束时体重恢复到实验初期。与之对比，OXTR△DC小鼠体重尽管也呈现波动性变化，但是在饮用正常水期间体重恢复迟缓，在造模结束时体重仍然低于造模初期。与OXTRfl/fl小鼠相比，OXTR△DC小鼠结肠更短，DAI评分和组织学评分更高。炎症因子I16和Il23的mRNA表达增加，而抑炎因子Tgfβ表达减少。
7.在慢性结肠炎小鼠中，OXTR△DC小鼠肠道固有层中T细胞倾向于向Th17方向分化
与OXTRfl/fl小鼠相比，OXTR△DC小鼠肠道Th17相关转录因子Rorγt的mRNA表达更高，而其他相关转录因子表达量无明显变化。
8.回输OXT孵育过的BMDCs缓解DSS诱导的小鼠急性结肠炎
BMDCs在有OXT(DC (OXT))或无OXT(DC(Control))孵育后经LPS刺激成熟。在回输BMDCs实验中，DC(OXT)组小鼠体重降低程度明显小于DC(Control)组小鼠和Control组小鼠。同样，DC(OXT)组小鼠结肠长度比DC(Control)组小鼠和Control小鼠长，DAI评分低，组织学评分低。
小结:
1.IBD患者血浆中OXT异常升高。
2.肠炎时，DCs的OXT信号影响LPDCs亚群比例及CD4+T细胞分化。当条件敲除DCs上OXTR(OXTR△DC)时，DSS诱导的结肠炎加重，肠黏膜CD103+CD11b+DCs亚群比例更高，CD4+T倾向于Th1及Th17分化。
3.静脉回输OXT孵育过的BMDCs能够缓解DSS诱导的结肠炎。这可能为临床治疗IBD提供新的方法参考。
实验结论与创新性:
1.OXT的抗炎作用已经被广泛认知，但是绝大多数的研究集中在巨噬细胞或者神经细胞上，我们的研究首次证明DCs表达OXTR，并且OXT通过激活DCs上的OXTR也起到了抗炎的作用。
2.在体外，OXT通过激活AKT通路下调NFκB活性，抑制DCs的成熟，抑制Th1和Th17分化，从而限制LPS诱导的炎症反应。
3.在体内，OXT信号系统影响CD103+CD11b+LPDCs亚群比例，抑制Th1和Th17分化，限制IBD的进一步发展。
4.静脉注射OXT孵育的BMDCs缓解DSS诱导的实验性结肠炎，可能为临床治疗IBD提供新的方法。
5.该研究进一步证明神经肽OXT参与免疫调节作用，为神经-免疫交流提供新的证据。