论文部分内容阅读
微生物次级代谢产物不仅是药物与生物农药的重要来源，也在微生物生态学中充当重要角色。假单胞菌和伯克氏菌都属变形菌门，假单胞菌合成的天然产物在人类、动物和植物的疾病预防中起着至关重要的作用，伯克氏菌是一种新兴的生物活性天然产物的来源菌，它们的基因组中含有大量未知的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster，BGC)，具有生物合成新结构的巨大潜力。传统的基因组挖掘策略有单一启动子替换、转录调控因子操作、外源功能基因添加、非目标代谢途径失活等，由于BGC结构和调控网络的复杂性，采取单一策略往往难以激活沉默基因簇，导致挖掘基因组的效率低下，大量的BGC资源仍尚待挖掘。对基因簇资源的深度挖掘需要借助高效的多元基因编辑技术对微生物基因组进行包含多种挖掘策略的系统性“改写”才能最终将基因簇资源转化为天然产物资源。
当前被广泛使用的细菌多元基因组编辑技术主要有基于CRISPR/Cas系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated nuclease)的多元基因编辑方法和基于Red/ET重组工程的多元基因迭代编辑方法技术(multiplex automated genome engineering，MAGE)。CRISPR/Cas系统作为异源外切酶介导双链断裂所带来的细胞毒性以及基因组多位点编辑时需要构建复杂的crRNAs表达载体等问题限制了在假单胞菌和伯克氏菌中的应用。传统基于Red/ET同源重组工程的基因组多元迭代编辑技术一般以单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)为底物，这在遗传基础研究和构建优化的微生物细胞工厂等方面有很大的优势。然而，由于千碱基以上尺度的ssDNA获取耗时费力、插入效率低下导致ssDNA重组工程相关的多元编辑技术介导的基因组多元编辑存在插入片段长度受限制、突变子的筛选效率低下、需要对基因组进行预编辑、适用范围窄等问题。
在本研究中，通过核糖核苷酸还原酶(RNR)过表达和脱氧核苷三磷酸(dNTP)添加介导细胞内dNTP浓度调控，建立了一种基于双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)recombineering的多元基因组工程(double-stranded DNA recombineering-assisted multiplex genome engineering，dReaMGE)技术，该技术兼具非ssDNA依赖、编辑位置灵活、筛选方法灵敏度高以及应用范围广等优点。dReaMGE可以介导大肠杆菌、假单胞菌和伯克氏菌等多种细菌的多元基因组编辑，只通过一轮重组在基因组上同时进行多个(1-6)千碱基尺度序列(0.25-90 kb)的替换以及删除和插入，而无需体外制备ssDNA、构建复杂的引导质粒、引发多个基因组双链断裂以及对错配修复系统的预干扰。dReaMGE在几天内可以完成以往采用传统重组工程需要耗时数月的基因组编辑工作，例如多个生物合成途径失活、启动子或基因插入、基因组精简和转录调控因子组合编辑，证明dReaMGE是探测基因型与表型关系、系统性改造细菌基因组的便捷工具，能够促进实现微生物基因簇资源的深度挖掘以及细胞工厂的构建，是对当前基因组工程技术一种理想补充。
位点特异性重组酶系统(site-specific recombination system，SSRs)由位点特异性重组酶和重组酶识别位点两部分组成，重组酶能够特异识别和结合识别位点，进而实现对两个识别位点之间目标DNA的切除、整合、倒置和移位等编辑工作，过去的工作证明对重组酶识别位点进行局部的突变能够获得仍能被重组酶有效识别和结合，但与野生型识别位点之间无法在进行反应的突变位点，从而拓展了对位点特异性重组酶系统的利用。目前最常用的位点特异性重组酶系统有Cre/lox系统和Flp/FRT系统，其中Cre/lox系统因其高效性而应用最为广泛，但是在其具有高效性的同时也具有很强的细胞毒性。Flp/FRT系统的效率远远低于Cre/lox系统同时也具有较强的细胞毒性，目前已有一系列的突变lox位点被开发并应用于基因组编辑工作。在应用dReaMGE等技术的复杂基因组编辑工程中，会涉及大量的基因和代谢途径的敲除、替换和插入等操作，因而需要借助SSRs用于筛选标记的删除以维持基因组的稳定性或者防止超级细菌的产生，而现有位点特异性重组酶系统的可用识别位点远远难以满足需求。来源于珊瑚弧菌的Vika/vox系统是一种新型的SSRs，由重组酶Vika和特异性识别位点vox组成，该系统与Cre/lox和Flp/FRT系统相比，具有细胞毒性低，使用范围广和安全性高等优势，本文中对vox位点进行突变获得了多个介导重组能力相较于原始vox位点显著增强的vox突变位点(vox2261、vox2272和vox226172)，和相较于lox位点更为安全严谨的vox突变位点(vox-66和vox-71)，为细菌基因组多元编辑工作提供了有效的工具元件，进一步扩展了位点特异性重组酶系统的应用范围。
本文基于Red/ET重组工程、dReaMGE和Vika/vox等细菌基因组多元编辑技术以及工具元件的开发，通过单个或多个启动子插入、转录调控因子的组合编辑、基因簇失活等策略完成了对一种假单胞菌和两种伯克氏菌的生物合成潜力的开发，成功实现对六个基因簇的编辑，一个活跃基因簇的深度挖掘，一种目标化合物产量的提高以及抗肿瘤化合物埃博霉素高效异源表达，获得了六种新型的天然产物。其中来自假单胞菌PseudomonasparafulvaCRS01-1的massetolides有抗枯草芽孢杆菌活性，来自伯克氏菌ParaburkholderiamegapolitanaDSM23488的haereomegapolitaninA具有表面活性剂活性，来源于伯克氏菌DSM7029的luminmycinG对人乳腺癌细胞株具有一定的抗肿瘤活性。以上结果显示，本文开发的包含dReaMGE和vika/vox在内的细菌基因组多元编辑技术与工具元件是对现有细菌基因组编辑工具箱的扩大和丰富，能够极大的加速对微生物基因簇资源的开发的转化。
当前被广泛使用的细菌多元基因组编辑技术主要有基于CRISPR/Cas系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated nuclease)的多元基因编辑方法和基于Red/ET重组工程的多元基因迭代编辑方法技术(multiplex automated genome engineering，MAGE)。CRISPR/Cas系统作为异源外切酶介导双链断裂所带来的细胞毒性以及基因组多位点编辑时需要构建复杂的crRNAs表达载体等问题限制了在假单胞菌和伯克氏菌中的应用。传统基于Red/ET同源重组工程的基因组多元迭代编辑技术一般以单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)为底物，这在遗传基础研究和构建优化的微生物细胞工厂等方面有很大的优势。然而，由于千碱基以上尺度的ssDNA获取耗时费力、插入效率低下导致ssDNA重组工程相关的多元编辑技术介导的基因组多元编辑存在插入片段长度受限制、突变子的筛选效率低下、需要对基因组进行预编辑、适用范围窄等问题。
在本研究中，通过核糖核苷酸还原酶(RNR)过表达和脱氧核苷三磷酸(dNTP)添加介导细胞内dNTP浓度调控，建立了一种基于双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)recombineering的多元基因组工程(double-stranded DNA recombineering-assisted multiplex genome engineering，dReaMGE)技术，该技术兼具非ssDNA依赖、编辑位置灵活、筛选方法灵敏度高以及应用范围广等优点。dReaMGE可以介导大肠杆菌、假单胞菌和伯克氏菌等多种细菌的多元基因组编辑，只通过一轮重组在基因组上同时进行多个(1-6)千碱基尺度序列(0.25-90 kb)的替换以及删除和插入，而无需体外制备ssDNA、构建复杂的引导质粒、引发多个基因组双链断裂以及对错配修复系统的预干扰。dReaMGE在几天内可以完成以往采用传统重组工程需要耗时数月的基因组编辑工作，例如多个生物合成途径失活、启动子或基因插入、基因组精简和转录调控因子组合编辑，证明dReaMGE是探测基因型与表型关系、系统性改造细菌基因组的便捷工具，能够促进实现微生物基因簇资源的深度挖掘以及细胞工厂的构建，是对当前基因组工程技术一种理想补充。
位点特异性重组酶系统(site-specific recombination system，SSRs)由位点特异性重组酶和重组酶识别位点两部分组成，重组酶能够特异识别和结合识别位点，进而实现对两个识别位点之间目标DNA的切除、整合、倒置和移位等编辑工作，过去的工作证明对重组酶识别位点进行局部的突变能够获得仍能被重组酶有效识别和结合，但与野生型识别位点之间无法在进行反应的突变位点，从而拓展了对位点特异性重组酶系统的利用。目前最常用的位点特异性重组酶系统有Cre/lox系统和Flp/FRT系统，其中Cre/lox系统因其高效性而应用最为广泛，但是在其具有高效性的同时也具有很强的细胞毒性。Flp/FRT系统的效率远远低于Cre/lox系统同时也具有较强的细胞毒性，目前已有一系列的突变lox位点被开发并应用于基因组编辑工作。在应用dReaMGE等技术的复杂基因组编辑工程中，会涉及大量的基因和代谢途径的敲除、替换和插入等操作，因而需要借助SSRs用于筛选标记的删除以维持基因组的稳定性或者防止超级细菌的产生，而现有位点特异性重组酶系统的可用识别位点远远难以满足需求。来源于珊瑚弧菌的Vika/vox系统是一种新型的SSRs，由重组酶Vika和特异性识别位点vox组成，该系统与Cre/lox和Flp/FRT系统相比，具有细胞毒性低，使用范围广和安全性高等优势，本文中对vox位点进行突变获得了多个介导重组能力相较于原始vox位点显著增强的vox突变位点(vox2261、vox2272和vox226172)，和相较于lox位点更为安全严谨的vox突变位点(vox-66和vox-71)，为细菌基因组多元编辑工作提供了有效的工具元件，进一步扩展了位点特异性重组酶系统的应用范围。
本文基于Red/ET重组工程、dReaMGE和Vika/vox等细菌基因组多元编辑技术以及工具元件的开发，通过单个或多个启动子插入、转录调控因子的组合编辑、基因簇失活等策略完成了对一种假单胞菌和两种伯克氏菌的生物合成潜力的开发，成功实现对六个基因簇的编辑，一个活跃基因簇的深度挖掘，一种目标化合物产量的提高以及抗肿瘤化合物埃博霉素高效异源表达，获得了六种新型的天然产物。其中来自假单胞菌PseudomonasparafulvaCRS01-1的massetolides有抗枯草芽孢杆菌活性，来自伯克氏菌ParaburkholderiamegapolitanaDSM23488的haereomegapolitaninA具有表面活性剂活性，来源于伯克氏菌DSM7029的luminmycinG对人乳腺癌细胞株具有一定的抗肿瘤活性。以上结果显示，本文开发的包含dReaMGE和vika/vox在内的细菌基因组多元编辑技术与工具元件是对现有细菌基因组编辑工具箱的扩大和丰富，能够极大的加速对微生物基因簇资源的开发的转化。