论文部分内容阅读
木质纤维素类生物质资源是地球上含量最丰富的可再生资源，基于木质纤维素资源降解的生物质炼制技术在以生物乙醇为代表的生物基产品及其它大宗生物产品生产领域具有广阔的应用前景和巨大的社会经济价值。木质纤维素在组成和结构上具有高度复杂性和异质性，其被有效水解需要多种糖苷水解酶组分的协同作用，且水解过程中对酶的热稳定性和催化能力等性质也有较高要求。因此，寻找和开发更多具备优良酶学特性和较高催化效率的新糖苷水解酶是目前木质纤维素降解研究的重点之一。
目前研究最为深入的木质纤维素酶生产的真菌菌株包括里氏木霉、草酸青霉和粗糙脉孢霉等，它们均属于嗜温真菌，所产生的木质纤维素酶的最适反应温度较低，热稳定性较弱，在实际生产应用中仍受到诸多的限制。耐热酶或嗜热酶由于具有较高的稳定性和催化活性，可明显提高对生物质资源的降解转化效率，在工业生产上具有很多中温酶不具备的优势。因此挖掘和开发具备优秀热稳定性的新型糖苷水解酶具有重要的应用价值。埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)是一株具有丰富糖苷水解酶编码潜力的嗜热丝状真菌，其可以在40-45℃环境下生长，具有较为完整的纤维素及半纤维素降解酶系，是开发耐热糖苷水解酶最具潜力的菌株之一。
本论文以埃默森篮状菌为研究对象，对其胞外糖苷水解酶表达合成情况进行了系统分析，并在此基础上围绕挖掘新型耐热糖苷水解酶这一目标开展了系统研究，主要研究成果如下:
1.对埃默森篮状菌胞外酶系进行了系统的活性分析和质谱鉴定，确认该菌糖苷酶资源丰富，可在胞外分泌高达22种糖苷酶水解酶家族的酶类，主要糖苷酶类具有显著的耐热性。
埃默森篮状菌在45℃条件下在木聚糖、葡萄糖或麸皮碳源下生长状态良好。在木聚糖及麸皮碳源条件下，在埃默森篮状菌的胞外发酵液中检测到了纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-半乳糖苷酶的活性，对粗酶液活性检测分析显示，这些酶的最适反应温度均在70-80℃之间，具有显著的耐热性。分析还表明，埃默森篮状菌发酵液中纤维素外切酶及纤维素内切酶的活性虽然较低，但β-葡萄糖苷酶的活性较高，其活性最高可达约1.5Uml-1，且β-葡萄糖苷酶存在一定程度的组成型表达。埃默森篮状菌的胞外木聚糖酶和β-木糖苷酶活性较为突出，在麸皮碳源下，该菌的胞外木聚糖酶活性可以达到约10.53Uml-1，在木聚糖碳源下，胞外β-木糖苷酶活性最高达到0.097Uml-1。在麸皮及木聚糖碳源条件下的胞外发酵液中还检测到了0.071Uml-1的α-阿拉伯呋喃糖苷酶和0.177Uml-1的α-半乳糖苷酶活性。通过质谱鉴定和分析发现，在微晶纤维素、麸皮及微晶纤维素麸皮混合碳源条件下，埃默森篮状菌胞外可分泌的糖苷水解酶种类繁多，分布在从GH1家族到GH93家族的22个糖苷水解酶家族中，包括大量未得到表征的酶类，其中半纤维素酶类在胞外总产酶中占12.14％-18.63％。除了糖苷水解酶外，还在胞外鉴定到了多种漆酶等与木质纤维素降解相关的酶类及大量未知蛋白。该工作为后续对这些酶的异源表达和酶学性质表征工作以及开发应用奠定了基础。
2.成功对耐热α-半乳糖苷酶ReGal2进行了异源表达纯化与酶学性质表征，表明ReGal2具有高热稳定性、高催化活性及对多种金属离子及蛋白变性剂的突出耐受力，有重要的应用开发价值。
通过质谱鉴定和基因组数据分析，发现埃默森篮状菌基因组中存在5个α-半乳糖苷酶编码基因，并对尚未报道的4个基因进行了异源表达。活性检测分析显示，4个重组酶的最适反应温度在50-80℃之间，其中ReGal2的最适反应温度最高。酶学性质表征显示，ReGal2的活性形式为同源6聚体蛋白，单体分子量为66kDa。ReGal2的最适反应温度为80℃，最适pH为4.0。ReGal2在70℃下保存60h后活性未受到任何影响，在80℃下孵育3h后其活性也几乎没有损失，在85℃下孵育60min仍能保持60％的活性，通过微量差示扫描量热仪测定其Tm值为97.9℃，是目前表征的热稳定性最强的α-半乳糖苷酶。ReGal2测得的α-半乳糖苷酶活性为935Umg-1，对合成底物pNPGal的动力学常数Km、kcat和kcat/Km分别为0.19mM，623.1s-1，3279s-1mM-1，表明其具有非常高的催化转化能力。同时ReGal2也表现出了对多种金属离子，化学试剂及高浓度盐的耐受力。进一步研究发现，ReGal2能够有效水解豆粕中的棉子糖和水苏糖等抗营养成分，在70℃下反应24h后，豆粕中的水苏糖、棉子糖等抗营养成分可被ReGal2完全水解。综上所述，ReGal2具有高热稳定性、高催化活性及对多种金属离子及蛋白变性剂的高耐受力，表明该酶具有高抗不良环境的能力，在食品、饲料加工等领域具有广阔的应用潜力。此外，我们还对其中一个α-N-乙酰半乳糖苷酶ReGal4进行了纯化和酶学性质表征。ReGal4的分子量为90kDa，其最适反应条件为60℃，pH4.0。ReGal4在50℃下孵育3h后活性几乎没有损失，在55℃下孵育30min后仍能保持42％的初始活性，与已报道的其它α-N-乙酰半乳糖苷酶相比具有更强的耐热性。ReGal4的活性受到多种金属离子和酶抑制剂的影响。ReGal4在最适条件下测得的酶活为34.9Umg-1，对合成底物4-NPGalNAC的催化动力学常数VmaxKm、kcat/Km分别为59.33Umg-1，61.69s-1，237.26mgs-1ml-1，与同类酶相比也表现出较强的水解活性。
3.完成了埃默森篮状菌耐热阿拉伯聚糖降解酶Abn93和Abf2的异源表达纯化与酶学性质表征，表明两个酶都具有较高的热稳定性，且Abn93具有高催化活性和高pH稳定性。
对埃默森篮状菌的胞外阿拉伯聚糖降解酶进行了分离纯化，通过质谱鉴定该酶为GH93家族的外切阿拉伯聚糖酶。对该外切阿拉伯聚糖酶Abn93和从基因组筛选得到的GH51家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf2进行了异源表达、纯化和酶学性质研究。Abn93的分子量为70kDa，最适反应温度为70℃，最适pH为4.0，在70℃下孵育3h后仍能保持68.04％的活性，通过微量差示扫描量热仪测定其Tm为80.49℃，是目前耐热性最强的外切阿拉伯聚糖酶。酶活性表征表明，Abn93表现出具有较强和较宽的pH耐受性，在pH3.0-9.0的条件下孵育6h后，其仍能保持89.03％以上的活性。Abn93催化水解能力强，特异性降解线性脱支阿拉伯聚糖，比酶活性为466.08Umg-1，‰和kcat/Km分别为1.89mgml-1和163.98mgs-1ml-1。Abn93催化水解脱支阿拉伯聚糖时从其末端切割，产物为阿拉伯二糖。对基因组筛选得到的GH51家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf2的酶学性质表征表明，Abf2的分子量为70kDa，最适反应温度为70℃，最适pH为4.0。Abf2对合成底物pNPX的Vmax和‰分别为69.94Umg-1，8.70mgml-1。Abf2在70℃下孵育3h后仍能保持40.78％的活性，Tm值为79.02℃，表现出了较强的热稳定性。Abf2的活性受金属离子和化学试剂影响较大。
4.实现了埃默森篮状菌耐热木聚糖酶Xyn10A的异源表达纯化并完成了酶学性质表征，结果表明该酶具有高催化活性和高耐热性，且具有多种糖苷酶功能。
通过质谱分析，在埃默森篮状菌的木聚糖诱导所产胞外酶系中鉴定到了一个GH10家族的木聚糖酶Xyn10A，在埃默森篮状菌基因组中克隆了该酶基因，并将其在毕赤酵母中进行了异源表达和纯化。检测分析显示该重组酶Xyn10A对木聚糖具有高水解活性和高耐热性，最适温度是80℃，最适pH为4.0左右，比酶活性为2589.59Umg-1，在70℃条件下孵育3h后仍维持原有活性，其催化性能和耐热性能优于多数已报道的木聚糖酶。酶活分析还表明，Xyn10A是一种多功能酶，除能够水解木聚糖外，还同时表现出β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，其比酶活分别为1.612Umg-1和0.2638Umg-1。Xyn10A的活性受到多种金属离子、化学试剂的抑制。
本论文主要对埃默森篮状菌胞外糖苷水解酶系进行了系统分析和鉴定，确认了该菌拥有丰富的糖苷水解酶资源，在此基础上对鉴定到的五个新型耐热糖苷水解酶进行了克隆表达，并对其基本酶学性质、水解模式、底物特异性及工业应用前景进行了深入的研究。发现的这些具有高热稳定性和催化能力的新型糖苷水解酶，为食品、饲料、能源等领域提供了性质优秀的耐热酶资源，具有巨大的工业应用潜力。
目前研究最为深入的木质纤维素酶生产的真菌菌株包括里氏木霉、草酸青霉和粗糙脉孢霉等，它们均属于嗜温真菌，所产生的木质纤维素酶的最适反应温度较低，热稳定性较弱，在实际生产应用中仍受到诸多的限制。耐热酶或嗜热酶由于具有较高的稳定性和催化活性，可明显提高对生物质资源的降解转化效率，在工业生产上具有很多中温酶不具备的优势。因此挖掘和开发具备优秀热稳定性的新型糖苷水解酶具有重要的应用价值。埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)是一株具有丰富糖苷水解酶编码潜力的嗜热丝状真菌，其可以在40-45℃环境下生长，具有较为完整的纤维素及半纤维素降解酶系，是开发耐热糖苷水解酶最具潜力的菌株之一。
本论文以埃默森篮状菌为研究对象，对其胞外糖苷水解酶表达合成情况进行了系统分析，并在此基础上围绕挖掘新型耐热糖苷水解酶这一目标开展了系统研究，主要研究成果如下:
1.对埃默森篮状菌胞外酶系进行了系统的活性分析和质谱鉴定，确认该菌糖苷酶资源丰富，可在胞外分泌高达22种糖苷酶水解酶家族的酶类，主要糖苷酶类具有显著的耐热性。
埃默森篮状菌在45℃条件下在木聚糖、葡萄糖或麸皮碳源下生长状态良好。在木聚糖及麸皮碳源条件下，在埃默森篮状菌的胞外发酵液中检测到了纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-半乳糖苷酶的活性，对粗酶液活性检测分析显示，这些酶的最适反应温度均在70-80℃之间，具有显著的耐热性。分析还表明，埃默森篮状菌发酵液中纤维素外切酶及纤维素内切酶的活性虽然较低，但β-葡萄糖苷酶的活性较高，其活性最高可达约1.5Uml-1，且β-葡萄糖苷酶存在一定程度的组成型表达。埃默森篮状菌的胞外木聚糖酶和β-木糖苷酶活性较为突出，在麸皮碳源下，该菌的胞外木聚糖酶活性可以达到约10.53Uml-1，在木聚糖碳源下，胞外β-木糖苷酶活性最高达到0.097Uml-1。在麸皮及木聚糖碳源条件下的胞外发酵液中还检测到了0.071Uml-1的α-阿拉伯呋喃糖苷酶和0.177Uml-1的α-半乳糖苷酶活性。通过质谱鉴定和分析发现，在微晶纤维素、麸皮及微晶纤维素麸皮混合碳源条件下，埃默森篮状菌胞外可分泌的糖苷水解酶种类繁多，分布在从GH1家族到GH93家族的22个糖苷水解酶家族中，包括大量未得到表征的酶类，其中半纤维素酶类在胞外总产酶中占12.14％-18.63％。除了糖苷水解酶外，还在胞外鉴定到了多种漆酶等与木质纤维素降解相关的酶类及大量未知蛋白。该工作为后续对这些酶的异源表达和酶学性质表征工作以及开发应用奠定了基础。
2.成功对耐热α-半乳糖苷酶ReGal2进行了异源表达纯化与酶学性质表征，表明ReGal2具有高热稳定性、高催化活性及对多种金属离子及蛋白变性剂的突出耐受力，有重要的应用开发价值。
通过质谱鉴定和基因组数据分析，发现埃默森篮状菌基因组中存在5个α-半乳糖苷酶编码基因，并对尚未报道的4个基因进行了异源表达。活性检测分析显示，4个重组酶的最适反应温度在50-80℃之间，其中ReGal2的最适反应温度最高。酶学性质表征显示，ReGal2的活性形式为同源6聚体蛋白，单体分子量为66kDa。ReGal2的最适反应温度为80℃，最适pH为4.0。ReGal2在70℃下保存60h后活性未受到任何影响，在80℃下孵育3h后其活性也几乎没有损失，在85℃下孵育60min仍能保持60％的活性，通过微量差示扫描量热仪测定其Tm值为97.9℃，是目前表征的热稳定性最强的α-半乳糖苷酶。ReGal2测得的α-半乳糖苷酶活性为935Umg-1，对合成底物pNPGal的动力学常数Km、kcat和kcat/Km分别为0.19mM，623.1s-1，3279s-1mM-1，表明其具有非常高的催化转化能力。同时ReGal2也表现出了对多种金属离子，化学试剂及高浓度盐的耐受力。进一步研究发现，ReGal2能够有效水解豆粕中的棉子糖和水苏糖等抗营养成分，在70℃下反应24h后，豆粕中的水苏糖、棉子糖等抗营养成分可被ReGal2完全水解。综上所述，ReGal2具有高热稳定性、高催化活性及对多种金属离子及蛋白变性剂的高耐受力，表明该酶具有高抗不良环境的能力，在食品、饲料加工等领域具有广阔的应用潜力。此外，我们还对其中一个α-N-乙酰半乳糖苷酶ReGal4进行了纯化和酶学性质表征。ReGal4的分子量为90kDa，其最适反应条件为60℃，pH4.0。ReGal4在50℃下孵育3h后活性几乎没有损失，在55℃下孵育30min后仍能保持42％的初始活性，与已报道的其它α-N-乙酰半乳糖苷酶相比具有更强的耐热性。ReGal4的活性受到多种金属离子和酶抑制剂的影响。ReGal4在最适条件下测得的酶活为34.9Umg-1，对合成底物4-NPGalNAC的催化动力学常数VmaxKm、kcat/Km分别为59.33Umg-1，61.69s-1，237.26mgs-1ml-1，与同类酶相比也表现出较强的水解活性。
3.完成了埃默森篮状菌耐热阿拉伯聚糖降解酶Abn93和Abf2的异源表达纯化与酶学性质表征，表明两个酶都具有较高的热稳定性，且Abn93具有高催化活性和高pH稳定性。
对埃默森篮状菌的胞外阿拉伯聚糖降解酶进行了分离纯化，通过质谱鉴定该酶为GH93家族的外切阿拉伯聚糖酶。对该外切阿拉伯聚糖酶Abn93和从基因组筛选得到的GH51家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf2进行了异源表达、纯化和酶学性质研究。Abn93的分子量为70kDa，最适反应温度为70℃，最适pH为4.0，在70℃下孵育3h后仍能保持68.04％的活性，通过微量差示扫描量热仪测定其Tm为80.49℃，是目前耐热性最强的外切阿拉伯聚糖酶。酶活性表征表明，Abn93表现出具有较强和较宽的pH耐受性，在pH3.0-9.0的条件下孵育6h后，其仍能保持89.03％以上的活性。Abn93催化水解能力强，特异性降解线性脱支阿拉伯聚糖，比酶活性为466.08Umg-1，‰和kcat/Km分别为1.89mgml-1和163.98mgs-1ml-1。Abn93催化水解脱支阿拉伯聚糖时从其末端切割，产物为阿拉伯二糖。对基因组筛选得到的GH51家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf2的酶学性质表征表明，Abf2的分子量为70kDa，最适反应温度为70℃，最适pH为4.0。Abf2对合成底物pNPX的Vmax和‰分别为69.94Umg-1，8.70mgml-1。Abf2在70℃下孵育3h后仍能保持40.78％的活性，Tm值为79.02℃，表现出了较强的热稳定性。Abf2的活性受金属离子和化学试剂影响较大。
4.实现了埃默森篮状菌耐热木聚糖酶Xyn10A的异源表达纯化并完成了酶学性质表征，结果表明该酶具有高催化活性和高耐热性，且具有多种糖苷酶功能。
通过质谱分析，在埃默森篮状菌的木聚糖诱导所产胞外酶系中鉴定到了一个GH10家族的木聚糖酶Xyn10A，在埃默森篮状菌基因组中克隆了该酶基因，并将其在毕赤酵母中进行了异源表达和纯化。检测分析显示该重组酶Xyn10A对木聚糖具有高水解活性和高耐热性，最适温度是80℃，最适pH为4.0左右，比酶活性为2589.59Umg-1，在70℃条件下孵育3h后仍维持原有活性，其催化性能和耐热性能优于多数已报道的木聚糖酶。酶活分析还表明，Xyn10A是一种多功能酶，除能够水解木聚糖外，还同时表现出β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，其比酶活分别为1.612Umg-1和0.2638Umg-1。Xyn10A的活性受到多种金属离子、化学试剂的抑制。
本论文主要对埃默森篮状菌胞外糖苷水解酶系进行了系统分析和鉴定，确认了该菌拥有丰富的糖苷水解酶资源，在此基础上对鉴定到的五个新型耐热糖苷水解酶进行了克隆表达，并对其基本酶学性质、水解模式、底物特异性及工业应用前景进行了深入的研究。发现的这些具有高热稳定性和催化能力的新型糖苷水解酶，为食品、饲料、能源等领域提供了性质优秀的耐热酶资源，具有巨大的工业应用潜力。