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流产是影响早期妊娠的关键因素。反复自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是一种常见妊娠并发症，它被定义为两次或更多次连续的自然流产。RSA的发生，是目前全球范围内面临的主要生育问题。无法解释的RSA(unexplained spontaneous abortion，URSA)通常与母胎界面的免疫学异常相关。但是，关于RSA如何发生的确切机制仍然未知。
硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)在体内主要以L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys)作为底物，通过两种酶:胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)以及胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)的催化而合成。CBS和CSE在多种器官中分布不同。近几年研究发现，H2S也存在于人生殖系统，参与多种生殖过程的调节。不仅如此，H2S也参与免疫调节，介导免疫耐受。然而，对于H2S信号如何在妊娠初期发挥作用，还不了解。
本研究旨在明确H2S是否影响妊娠初期胚胎的发育以及其发挥作用的机制。实验表明，一方面CBS/H2S信号系统通过调节金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)干扰滋养细胞迁移和侵袭，从而影响早孕。在临床样本的研究中发现，RSA孕妇的绒毛组织CBS而非CSE蛋白表达显著降低，且其降低主要发生在细胞滋养层而非合体滋养层。滋养层细胞系HTR8/SVneo以及JEG3均能合成H2S。并且，我们发现外源性给予H2S或内源性过表达CBS均能引起MMP2及VEGF的上调从而促进细胞的迁移和侵袭。体内实验，利用CBS敲基因鼠及药理学干预的方法发现，CBS缺乏或者抑制均能够引起孕12.5天的小鼠发生胚胎吸收现象。重要的是，上述流产小鼠给予外源性H2S供体治疗后，能有效改善其胚胎吸收现象。同时，♀CBA/Jx♂DBA/2自然流产小鼠模型也证实了H2S的挽救作用。另一方面，我们的实验结果证明CBS/H2S信号通过干扰滋养层细胞NF-κB炎症途径及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)及环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX2)、前列腺素2(prostaglandin E2，PGE2)等细胞因子的释放发挥免疫调节作用，影响母胎界面辅助型T细胞1型(Type 1 Thelper，TH1)与辅助型T细胞2型(Type 2 T helper，TH2)细胞因子的比率。上述这些细胞因子的代谢紊乱能够导致RSA的发生，CBS衍生的H2S对于维持免疫稳态是至关重要的。体外研究发现，CBS抑制或者缺乏引起吸收胚胎蜕膜组织中TH2型细胞因子(IL-4、IL-6)水平显著降低，而TH1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α)增高或者没有发生改变，导致TH1/TH2增高。另外，低剂量外源性H2S供体以及CBS过表达均能引起HTR8/SVneo细胞HCG的改变，然而吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)及胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)没有明显差异。在对CBS过表达或敲低后的HTR8细胞进行RNA-seq差异分析后发现:CBS/H2S靶向NF-κB信号通路;白细胞介素-1受体1(IL-1R1)，前列腺素合酶2(PTGS2/COX2)富集于NF-κB信号通路以及炎症有关的过程。并且，CBS/H2S影响IL-1R1、COX2水平及PGE2的分泌，CBS过表达能够下调IL-1R1、COX2及PGE2。经Western验证，NF-κB炎症信号通路中关键蛋白P-IKB以及P-P65，在CBS过表达时均明显下调，P65没有改变。总之，H2S信号在维持早孕中起着重要作用，我们认为其可能是通过干扰滋养层细胞入侵以及调控母胎界面的免疫耐受从而影响TH1/TH2平衡实现的。
第一部分H2S通过干扰滋养细胞入侵影响早孕及其作用机制研究
研究目的
1、H2S信号系统在母胎界面的表达特征
2、H2S信号异常能否引起异常妊娠
3、H2S信号如何影响滋养细胞的迁移及侵袭
研究方法
1、Westernblot技术，确定人绒毛滋养细胞CBS和CSE蛋白表达。通过免疫组化确认绒毛及蜕膜中CBS、CSE的表达特征。
2、H2S合成与释放技术，确定人滋养细胞能够生成H2S。
3、通过病毒转染技术，过表达或敲低人滋养细胞HTR8/SVneoCBS。Transwell技术用于H2S信号系统对人滋养细胞迁移及侵袭能力的影响。Westernblot方法，进一步检测H2S信号系统对人滋养细胞中MMP2、VEGF表达的影响。
4、通过CBS敲除小鼠模型以及药物干预内源性H2S产生，检测CBS缺失及H2S产生障碍对小鼠胚胎吸收的影响，并且进一步确认给予外源性H2S供体治疗后是否可以改善流产小鼠的胚胎吸收现象。
研究结果
1、妊娠早期的胎盘绒毛组织中均有CBS、CSE蛋白表达，相较于门诊正常流产的孕妇，URSA患者的绒毛中CBS降低，而CSE变化不明显。并且URSA组绒毛中CBS降低主要发生在细胞滋养层，而非合体滋养层。
2、在HTR8/SVneo和JEG3两种细胞系中均检测到了CBS和CSE蛋白，且能够产生内源性H2S。CBS抑制剂氨基氧乙酸(AOAA)和CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(PAG)能减少H2S的合成。
3、多种浓度外源性的H2S供体硫氢化钠(NaHS)或合成前体L-半胱氨酸(L-Cys)，均能够增强人滋养细胞迁移及侵袭，并且迁移及侵袭能力的改变对供体浓度具有依赖性。同样，内源性CBS也能增加HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭。
4、H2S供体能够促进人滋养细胞MMP2、VEGF的表达，且对供体浓度具有一定的依赖性。CBS的过表达可引起MMP2和VEGF蛋白表达上调，而CBS的下调则相反。
5、CBS敲除小鼠显示出明显的胚胎吸收现象，同样H2S生物合成酶抑制剂AOAA或PAG也可诱发怀孕小鼠出现胚胎吸收。重要的是，使用H2S缓释供体GYY4137或NaHS的治疗可挽救AOAA处理或CBS缺失引起的小鼠胚胎丢失。
研究结论
1、URSA患者妊娠早期绒毛组织中CBS表达降低，且主要发生在其细胞的滋养层。
2、CBS/H2S促进人滋养细胞迁移和侵袭。
3、CBS/H2S促进人滋养细胞MMP2、VEGF的表达。
4、CBS敲除及药理学阻断H2S合成均能导致明显的小鼠胚胎吸收现象，给予H2S供体能够有效改善。
第二部分H2S通过调控母胎界面TH1/TH2平衡影响早孕及其作用机制研究
研究目的
1、H2S信号对自然流产小鼠模型的影响
2、发生胚胎吸收的蜕膜中细胞因子的变化
3、H2S信号是否介导绒毛滋养细胞免疫介质的合成及释放
4、滋养细胞CBS/H2S靶向作用的信号通路
研究方法
1、RT-qPCR以及ELISA技术，检测CBS敲除或药物抑制是否影响吸收胚胎蜕膜中TH1及TH2相关细胞因子的表达。
2、ELISA技术，检测HCG、TSLP、IDO以及PGE2的改变。
3、RNA-seq技术，明确CBS/H2S靶向作用的信号通路。
4、RT-qPCR方法，验证H2S供体及上调或下调CBS对滋养细胞白细胞介素-1受体1(IL-1R1)及环氧合酶2(COX2)表达的改变。
5、Westernblot方法，检测NF-κB通路参与炎症反应的关键蛋白。
研究结果
1、H2S供体GYY4137和NaHS能够挽救自然流产小鼠的胚胎吸收并促进蜕膜中TGF-β的表达。
2、给予AOAA或PAG处理，吸收胚胎蜕膜中的TH2型细胞因子(IL-4及IL-6)表达下降，而TH1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α)则不会显著改变。与此一致，CBS缺失也会致使TH2减少以及TH1不变或增多。
3、低剂量的H2S能够抑制人滋养细胞的HCG分泌，而对TSLP及IDO影响不大。CBS过表达也能够降低人滋养细胞HCG水平，而CBS敲低则相反。
4、RNA-seq差异分析发现CBS/H2S靶向NF-κB信号传导途径。利用Westernblot进一步证实了CBS过表达可以下调NF-κB信号通路和炎症反应相关生物学过程的IL-1R1、COX2及PGE2水平，而CBS下调则相反;CBS过表达能够下调NF-κB通路中关键炎性蛋白P-P65以及P-IKB的水平。
研究结论
1、H2S能够改善胚胎的吸收现象。
2、CBS/H2S代谢紊乱引起的胚胎吸收有可能与蜕膜中Th1/Th2失衡相关。
3、H2S可能通过影响母胎界面HCG、PGE2等的释放维持孕期免疫耐受。
4、CBS/H2S靶向作用于NF-κB信号通路。
硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)在体内主要以L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys)作为底物，通过两种酶:胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)以及胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)的催化而合成。CBS和CSE在多种器官中分布不同。近几年研究发现，H2S也存在于人生殖系统，参与多种生殖过程的调节。不仅如此，H2S也参与免疫调节，介导免疫耐受。然而，对于H2S信号如何在妊娠初期发挥作用，还不了解。
本研究旨在明确H2S是否影响妊娠初期胚胎的发育以及其发挥作用的机制。实验表明，一方面CBS/H2S信号系统通过调节金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)干扰滋养细胞迁移和侵袭，从而影响早孕。在临床样本的研究中发现，RSA孕妇的绒毛组织CBS而非CSE蛋白表达显著降低，且其降低主要发生在细胞滋养层而非合体滋养层。滋养层细胞系HTR8/SVneo以及JEG3均能合成H2S。并且，我们发现外源性给予H2S或内源性过表达CBS均能引起MMP2及VEGF的上调从而促进细胞的迁移和侵袭。体内实验，利用CBS敲基因鼠及药理学干预的方法发现，CBS缺乏或者抑制均能够引起孕12.5天的小鼠发生胚胎吸收现象。重要的是，上述流产小鼠给予外源性H2S供体治疗后，能有效改善其胚胎吸收现象。同时，♀CBA/Jx♂DBA/2自然流产小鼠模型也证实了H2S的挽救作用。另一方面，我们的实验结果证明CBS/H2S信号通过干扰滋养层细胞NF-κB炎症途径及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)及环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX2)、前列腺素2(prostaglandin E2，PGE2)等细胞因子的释放发挥免疫调节作用，影响母胎界面辅助型T细胞1型(Type 1 Thelper，TH1)与辅助型T细胞2型(Type 2 T helper，TH2)细胞因子的比率。上述这些细胞因子的代谢紊乱能够导致RSA的发生，CBS衍生的H2S对于维持免疫稳态是至关重要的。体外研究发现，CBS抑制或者缺乏引起吸收胚胎蜕膜组织中TH2型细胞因子(IL-4、IL-6)水平显著降低，而TH1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α)增高或者没有发生改变，导致TH1/TH2增高。另外，低剂量外源性H2S供体以及CBS过表达均能引起HTR8/SVneo细胞HCG的改变，然而吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)及胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)没有明显差异。在对CBS过表达或敲低后的HTR8细胞进行RNA-seq差异分析后发现:CBS/H2S靶向NF-κB信号通路;白细胞介素-1受体1(IL-1R1)，前列腺素合酶2(PTGS2/COX2)富集于NF-κB信号通路以及炎症有关的过程。并且，CBS/H2S影响IL-1R1、COX2水平及PGE2的分泌，CBS过表达能够下调IL-1R1、COX2及PGE2。经Western验证，NF-κB炎症信号通路中关键蛋白P-IKB以及P-P65，在CBS过表达时均明显下调，P65没有改变。总之，H2S信号在维持早孕中起着重要作用，我们认为其可能是通过干扰滋养层细胞入侵以及调控母胎界面的免疫耐受从而影响TH1/TH2平衡实现的。
第一部分H2S通过干扰滋养细胞入侵影响早孕及其作用机制研究
研究目的
1、H2S信号系统在母胎界面的表达特征
2、H2S信号异常能否引起异常妊娠
3、H2S信号如何影响滋养细胞的迁移及侵袭
研究方法
1、Westernblot技术，确定人绒毛滋养细胞CBS和CSE蛋白表达。通过免疫组化确认绒毛及蜕膜中CBS、CSE的表达特征。
2、H2S合成与释放技术，确定人滋养细胞能够生成H2S。
3、通过病毒转染技术，过表达或敲低人滋养细胞HTR8/SVneoCBS。Transwell技术用于H2S信号系统对人滋养细胞迁移及侵袭能力的影响。Westernblot方法，进一步检测H2S信号系统对人滋养细胞中MMP2、VEGF表达的影响。
4、通过CBS敲除小鼠模型以及药物干预内源性H2S产生，检测CBS缺失及H2S产生障碍对小鼠胚胎吸收的影响，并且进一步确认给予外源性H2S供体治疗后是否可以改善流产小鼠的胚胎吸收现象。
研究结果
1、妊娠早期的胎盘绒毛组织中均有CBS、CSE蛋白表达，相较于门诊正常流产的孕妇，URSA患者的绒毛中CBS降低，而CSE变化不明显。并且URSA组绒毛中CBS降低主要发生在细胞滋养层，而非合体滋养层。
2、在HTR8/SVneo和JEG3两种细胞系中均检测到了CBS和CSE蛋白，且能够产生内源性H2S。CBS抑制剂氨基氧乙酸(AOAA)和CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(PAG)能减少H2S的合成。
3、多种浓度外源性的H2S供体硫氢化钠(NaHS)或合成前体L-半胱氨酸(L-Cys)，均能够增强人滋养细胞迁移及侵袭，并且迁移及侵袭能力的改变对供体浓度具有依赖性。同样，内源性CBS也能增加HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭。
4、H2S供体能够促进人滋养细胞MMP2、VEGF的表达，且对供体浓度具有一定的依赖性。CBS的过表达可引起MMP2和VEGF蛋白表达上调，而CBS的下调则相反。
5、CBS敲除小鼠显示出明显的胚胎吸收现象，同样H2S生物合成酶抑制剂AOAA或PAG也可诱发怀孕小鼠出现胚胎吸收。重要的是，使用H2S缓释供体GYY4137或NaHS的治疗可挽救AOAA处理或CBS缺失引起的小鼠胚胎丢失。
研究结论
1、URSA患者妊娠早期绒毛组织中CBS表达降低，且主要发生在其细胞的滋养层。
2、CBS/H2S促进人滋养细胞迁移和侵袭。
3、CBS/H2S促进人滋养细胞MMP2、VEGF的表达。
4、CBS敲除及药理学阻断H2S合成均能导致明显的小鼠胚胎吸收现象，给予H2S供体能够有效改善。
第二部分H2S通过调控母胎界面TH1/TH2平衡影响早孕及其作用机制研究
研究目的
1、H2S信号对自然流产小鼠模型的影响
2、发生胚胎吸收的蜕膜中细胞因子的变化
3、H2S信号是否介导绒毛滋养细胞免疫介质的合成及释放
4、滋养细胞CBS/H2S靶向作用的信号通路
研究方法
1、RT-qPCR以及ELISA技术，检测CBS敲除或药物抑制是否影响吸收胚胎蜕膜中TH1及TH2相关细胞因子的表达。
2、ELISA技术，检测HCG、TSLP、IDO以及PGE2的改变。
3、RNA-seq技术，明确CBS/H2S靶向作用的信号通路。
4、RT-qPCR方法，验证H2S供体及上调或下调CBS对滋养细胞白细胞介素-1受体1(IL-1R1)及环氧合酶2(COX2)表达的改变。
5、Westernblot方法，检测NF-κB通路参与炎症反应的关键蛋白。
研究结果
1、H2S供体GYY4137和NaHS能够挽救自然流产小鼠的胚胎吸收并促进蜕膜中TGF-β的表达。
2、给予AOAA或PAG处理，吸收胚胎蜕膜中的TH2型细胞因子(IL-4及IL-6)表达下降，而TH1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α)则不会显著改变。与此一致，CBS缺失也会致使TH2减少以及TH1不变或增多。
3、低剂量的H2S能够抑制人滋养细胞的HCG分泌，而对TSLP及IDO影响不大。CBS过表达也能够降低人滋养细胞HCG水平，而CBS敲低则相反。
4、RNA-seq差异分析发现CBS/H2S靶向NF-κB信号传导途径。利用Westernblot进一步证实了CBS过表达可以下调NF-κB信号通路和炎症反应相关生物学过程的IL-1R1、COX2及PGE2水平，而CBS下调则相反;CBS过表达能够下调NF-κB通路中关键炎性蛋白P-P65以及P-IKB的水平。
研究结论
1、H2S能够改善胚胎的吸收现象。
2、CBS/H2S代谢紊乱引起的胚胎吸收有可能与蜕膜中Th1/Th2失衡相关。
3、H2S可能通过影响母胎界面HCG、PGE2等的释放维持孕期免疫耐受。
4、CBS/H2S靶向作用于NF-κB信号通路。