论文部分内容阅读
背景及目的:下咽鳞状细胞癌（HSCC）是头颈肿瘤中恶性程度极高的一类肿瘤,由于其发病部位隐匿,初发症状无特异性,患者往往容易忽略,诊断时绝大多数患者处于中晚期。目前下咽癌的主要治疗手段包括手术、放化疗、免疫治疗、靶向治疗等。然而治疗效果并不让人满意。手术后生活质量低下,术后复发,放化疗带来的严重副作用,使临床及科研工作者都迫切的需要了解下咽癌发病的分子机制,以便研发新的药物,发现新的检测及评估手段,来提高诊疗水平。Lnc RNA是一类长链非编码RNA,在许多肿瘤中都有相关的研究,在不同肿瘤中扮演的角色不一样,越来越多的证据表明Lnc RNA在肿瘤的发生发展过程中起很重要的作用。包括调控肿瘤增殖、转移、侵袭、凋亡、化疗耐药等。但在下咽癌中,Lnc RNA的研究较少,Lnc RNA通过何种方式影响下咽肿瘤的进展,有待我们进一步的研究。程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）是PD-1的配体之一,主要表达于T淋巴细胞表面,促进免疫逃逸,在下咽癌中,PD-L1的高表达促进HSCC细胞逃避宿主免疫系统的识别,并加速转移。事实上,Lnc RNA可以调控PD-L1的表达,从而促进肿瘤的免疫逃逸,但在下咽癌具体的作用机制尚不清楚。方法:（1）取经手术后病理诊断的下咽鳞癌患者癌及癌旁组织3对,构建差异Lnc RNA的基因芯片,采用P-value＜0.05,z|log2（Fc）|＞2的标准筛选差异Lnc RNA,并将Lnc RNA按差异倍数的高低进行排序,筛选Lnc RNA;结合文献,我们将HOXA11-AS1和PD-L1确定为下一步研究目标,原因在于,HOXA11-AS1是HOXA11的反义Lnc RNA,而HOXA11-AS在人体多种肿瘤中起调控作用,而HOXA11-AS1在下咽癌中尚未见报道,PD-L1广泛介导肿瘤的免疫逃逸,有研究报道PD-L1促进下咽癌的肿瘤逃逸和转移。我们首先在40对下咽癌及癌旁组织中进行qRT-PCR实验检测HOXA11-AS1及PD-L1相对表达量,采用GAPDH进行基因表达归一化,用POWER函数进行数据处理,绘制点状图;以中位数（小于中位数为低表达,大于或等于中位数为高表达）作为临界值,进行Kaplan-Meier曲线生存分析,用Pearson相关系数进行HOXA11-AS1与PD-L1的相关性分析,并对HOXA11-AS1进行临床病理分析。采用Jaspar及Starbase数据库预测HOXA11-AS1及PD-L1靶蛋白;（2）采用qRT-PCR检测鼻咽永生化上皮细胞（NP69）、下咽癌细胞（Fa Du）、人咽头癌胸水转移细胞系（Detroit562）中HOXA11-AS1、PD-L1、FOSL1的表达量,采用Western blot和免疫组化（IHC）分别检测PD-L1在细胞及组织中的表达;构建沉默HOXA11-AS1的慢病毒细胞株,在Fa Du细胞系和Detroit 562细胞系中转染,检验沉默效率;采用Western blot及免疫荧光检测对照组与沉默组中PD-L1的表达水平,加或不加抗PD-L1抗体,利用流式细胞学检测CD8+T细胞和CD4+T细胞的百分比;用ELISA法检测干扰素-γ的浓度;进行CCK-8检测细胞生长活力,集落形成实验、细胞划痕、transwell实验检测其对细胞增殖及迁移的影响;在Fa Du细胞中进行核质分离实验,检测HOXA11-AS1在细胞核与细胞质中的表达情况;（3）qRT-PCR实验检测FOSL1在下咽癌及癌旁组织中表达,以点状图表示,并进行生存分析,绘制Kaplan-Meier曲线;沉默FOSL1后,检测FOSL1及PD-L1的表达;采用染色质免疫共沉淀（Chi P）和双荧光素酶报告实验验证FOSL1与PD-L1启动子之间的调控关系;放线菌素D（ACD）处理沉默HOXA11-AS1组与对照组细胞,检测FOSL1m RNA的表达;RNA pulldown实验验证HOXA11-AS1与FOSL1之间的调控关系;RIP实验检测PTBP1与FOSL1及HOXA11-AS1的结合丰度;构建沉默PTBP1慢病毒稳转株,qRTPCR实验检测PTBP1、HOXA11-AS1、FOSL1的表达,检测经放线菌素（ACD）处理的对照组和沉默组FOSL1m RNA、HOXA11-AS1的表达情况;（4）构建过表达HOXA11-AS1及PTBP1的慢病毒稳转株,qRTPCR及Western实验检测HOXA11-AS1、FOSL1、PD-L1的表达水平;将HOXA11-AS1、sh PTBP1、HOXA11-AS1+sh-PTBP1的组合导入Fa Du和Detroit细胞,Western blot实验检测对照NC组、过表达HOXA11-AS1组、沉默PTBP1组、过表达HOXA11-AS1+sh-PTBP1组中PTBP1、FOSL1、PD-L1的表达;将HOXA11-AS1、sh-PD-L1、HOXA11-AS1+sh PD-L1的组合导入Fa Du和Detroit细胞,Western blot实验检测NC、HOXA11-AS1、sh-PD-L1或HOXA11-AS1+sh-PD-L1细胞中PTBP1、FOSL1和PD-L1的相对表达;用流式细胞仪检测CD8+、CD4+T细胞的百分率;用ELISA法检测干扰素-γ的浓度;用CCK-8、集落形成、伤口愈合和Transwell实验检测细胞的活性、集落形成、迁移和侵袭能力;（5）将稳定表达sh-NC、sh-HOXA11-AS11或sh-HOXA11-AS1-2的Fa Du和Detroit细胞注射到NOD-SCID裸鼠皮下建立异种移植模型,（n=48）,将其按PBS组和PBMCs注射组划分,用HE、Ki67和IHC染色检测加或不加PBMCs或PBS处理的移植瘤的病理、增殖和PD-L1的表达;检测移植瘤中Ki67细胞的百分率;计算sh-NC、shHOXA11-AS1-1和sh-HOXA11-AS1-2移植瘤的移植体积来衡量加或不加PBMCs或PBS治疗的细胞毒效应;在体内检测HOXA11-AS1基因敲除后的肿瘤体积和重量;用qRT-PCR法检测HOXA11-AS水平;用Western Blot实验检测HOXA11-AS1基因敲除后瘤体中PD-L1、FOSL1和PTBP1的表达;HE染色检测HOXA11-AS1基因敲除后裸鼠肺转移能力、肿瘤病理和肺转移结节数。结果:（1）芯片中差异Lnc RNA 807个,其中542个上调和265个下调。以阈值|log FC|＞2且p-value＜0.05;进一步缩小范围,lnc RNA的核苷酸序列长度＜3000,剔除＜200的group-Treatment（raw）与groupNormal（raw）数据)进一步筛选,符合筛选要求并上调的lnc RNA 67个,其中包含HOXA11-AS1;qRT-PCR实验结果显示HOXA11-AS1在癌组织中的表达是癌旁的1.55倍（P=0.0023）;PD-L1在下咽癌中表达是癌旁的1.57倍（P=0.0006）;HOXA11-AS1的表达与总生存时间负相关（P=0.0282）;PD-L1与下咽癌总生存时间负相关（P=0.0301）;Pearson分析显示HOXA11-AS1的表达与PD-L1呈正相关（P=0.0015,相关系数=0.2363）;HOXA11-AS1的表达与肿瘤大小（P=0.0011）、淋巴结转移（P=0.0245）、远处转移（P=0.0225）、T分期（P=0.0230）显著相关,与年龄无明显相关性（P=0.1167）;GEPIA数据库显示FOSL1在头颈肿瘤中高表达,并预后呈负相关;Jaspar预测FOSL1与PD-L1启动子之间存在结合位点;Starbase数据预测HOXA11-AS1、FOSL1分别与多嘧啶结合蛋白1（PTBP1）之间存在结合序列。（2）qRT-PCR实验显示HOXA11-AS1在Fa Du细胞中的相对表达量是NP69中的4.95倍（P=0.0006）,在Detroit562细胞中是NP69中的4.66倍（P=0.0008）;Western blot实验显示PD-L1在Fa Du细胞中的相对表达量是是NP69中的2.71倍（P=0.0017）,在Detroit562细胞中是NP69中的1.90倍（P=0.0344）;FOSL1在Fa Du细胞中的相对表达量是是NP69中的3.10倍（P=0.0009）,在Detroit562细胞中是NP69中的1.83倍（P=0.0179）;免疫组化显示PD-L1在下咽癌组织中高表达;沉默HOXA11-AS1或抗PD-L1治疗可增加PBMCs中CD8+T细胞的百分比及干扰素浓度,并且降低PBMC中的CD4+T细胞百分比;沉默HOXA11-AS1抑制细胞活力、减弱细胞增殖与迁移能力;Fa Du细胞中,HOXA11-AS1主要定位于细胞质中。（3）qRT-PCR实验显示,FOSL1在下咽癌组织中高表达,癌组织中的相对表达是癌旁的1.45倍（P=0.0036）;FOSL1的表达与总生存时间呈负相关,与GEPIA数据库分析一致;沉默FOSL1降低PD-L1的表达;染色质免疫共沉淀（Chi P）和双荧光素酶报告实验证实FOSL1与PD-L1启动子结合;沉默HOXA11-AS1降低FOSL1m RNA的稳定性;RNA pulldown实验证实HOXA11-AS1与FOSL1相互结合;RNA结合免疫蛋白沉淀（RIP）结果显示PTBP1与HOXA11-AS1相互作用;双荧光素酶报告实验显示PTBP1与FOSL1相互作用;qRT-PCR实验显示沉默PTBP1降低HOXA11-AS1及FOSL1的表达,并缩短FOSL1与HOXA11-AS1的m RNA衰减率;（4）过表达HOXA11-AS1及PTBP1可以增强FOSL1、PTBP1、HOXA11-AS1及PD-L1的表达;沉默PTBP1可以部分逆转HOXA11-AS1过表达引起的FOSL1和PD-L1的上调;沉默PD-L1逆转HOXA11-AS1过表达引起的PD-L1的上调,而PTBP1与FOSL1无明显变化;由于HOXA11-AS1提高HSCC细胞中PD-L1的水平,并促进增殖和转移,因此,我们研究了PD-L1在HOXA11-AS1过表达细胞中的调节机制。HOXA11-AS1过表达降低了CD8+T细胞百分比,而增加了CD4+T细胞百分比。而PD-L1基因的下调导致了相反的结果,并部分逆转了HOXA11-AS1过表达诱导的CD4+T淋巴细胞的增加。此外,PD-L1基因敲除增加了因HOXA11-AS1过表达而减少的干扰素-γ浓度,表明HOXA11-AS1通过调节PD-L1促进了HSCC细胞的免疫逃逸。同样,HOXA11-AS1增强促进了细胞的增殖、迁移和侵袭,而这些影响被PD-L1基因敲除而逆转。因此,我们证实了HOXA11-AS1/PDL1/PTBP1/FOSL1轴在体外促进HSCC进展中的作用。（5）体内实验显示,沉默HOXA11-AS1组并使用经腹腔注射PBMCs或PBS裸鼠肿瘤的病理和增殖程度以及PD-L1和Ki-67的表达都有所降低,而HOXA11-AS1的沉默和PBMCs的共同作用组这些作用进一步增强,表明HOXA11-AS1缺失在体内具有有效的抗肿瘤作用。沉默HOXA11-AS1后肿瘤体积减小、重量减轻,体内PTBP1、FOSL1和PD-L1水平下降。HOXA11-AS1的缺失降低肿瘤转移到肺的能力。结论:HOXA11-AS1可以通过结合PTBP1提高FOSL1m RNA的稳定,从而上调PD-L1的表达,致使肿瘤细胞活性增强,促进下咽癌的增殖及转移。图44幅,表14个,参考文献247篇